【文章內(nèi)容簡介】 ................................................... 27 不同濃度 PEGMnO NPs 的制備 ......................................................... 28 7860 腎癌細(xì)胞 的培養(yǎng) .......................................................................... 28 PEGMnO 的 MTT 測試 ....................................................................... 30 結(jié)果與討論 ...................................................................................................... 30 7860 腎癌細(xì)胞形態(tài)表征 ...................................................................... 30 7860 腎癌細(xì)胞存活率的測定 .............................................................. 31 本章小結(jié) .......................................................................................................... 31 8 總結(jié)與展望 .......................................................................................... 32 總結(jié) ......................................................... 32 展望 ......................................................... 32 翻譯 .................................................................................................................................. 37 英文原文 ................................................................................................................... 37 中文翻譯 ................................................................................................................... 44 致謝 ................................................................................................................................ 49 徐州醫(yī)學(xué)院 2021 屆本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 1 頁 1 緒論 研究背景及意義 隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，醫(yī)學(xué)影像設(shè)備的成像質(zhì)量也在不斷完善中，從 1895 年倫琴發(fā)現(xiàn) X 線起， CR、 DR、 CT 等設(shè)備在臨床疾病診斷中占據(jù)著重要的地位，而磁共振成像（ MRI）因具有較高軟組織分辨率以及多序列、多參數(shù)、多方位成像等優(yōu)勢，因此， MRI 已經(jīng)成為臨床實(shí)踐中最常用影像檢查手段之 一，也成為醫(yī)學(xué)影像中一個(gè)熱門的研究方向。但由于很多病變與正常組織的 T T2弛豫時(shí)間差別不大，尤其是當(dāng)病變較小時(shí)，平掃常不易顯示 [1]。另外，有些病變雖有明顯的信號(hào)異常，但定性與鑒別診斷仍較困難。因此，磁共振對比劑的應(yīng)用更是極大地拓展了磁共振成像技術(shù)的臨床診斷范圍 [24]，應(yīng)用合適的對比劑有助于增加 MRI 的敏感度和特異度 [5]。 傳統(tǒng) X 射線和 CT 診斷對比所用對比劑的增強(qiáng)原理，是對比劑本身對 X 射線的阻擋作用直接造成的，而 MRI 對比劑本身不產(chǎn)生信號(hào)，信號(hào)來自氫原子核。其基本原理是通過改變內(nèi)、外界弛豫效應(yīng)和磁化 率效應(yīng)間接地改變組織的信號(hào)強(qiáng)度，從而達(dá)到提高不同組織間信號(hào)差異的目的。 MRI 對比劑接近有關(guān)質(zhì)子后，可縮短這些質(zhì)子的弛豫時(shí)間，間接地改變這些質(zhì)子所產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度，提高正常與患病部位的成像對比度，從而顯示體內(nèi)器官的功能狀態(tài)，是用來縮短成像時(shí)間的成像增強(qiáng)對比劑。按照對比中以縮短 T1弛豫時(shí)間為主（使磁共振信號(hào)增加）或以縮短T2 弛豫時(shí)間為主（使磁共振信號(hào)下降），可將磁共振分為 T1 弛豫增強(qiáng)對比或 T2弛豫增強(qiáng)對比， T1和 T2弛豫時(shí)間的倒數(shù)，即 1/T1和 1/T2為兩者的弛豫率，弛豫效率為對比劑濃度和弛豫率關(guān)系的斜線。 另外一 種對比方法為使用一些無質(zhì)子的物質(zhì)或抗磁性物質(zhì)，目前主要應(yīng)用于胃腸腔對比 [6]。 目前，臨床使用的磁共振對比劑種類繁多，可按照不同的分類方式加以區(qū)分 :按引人體內(nèi)方式分為血管內(nèi)對比劑 (最為廣泛的使用方式 )和口服對比劑 (消化道內(nèi)使用 )；按增強(qiáng)類型分為陽性對比劑和陰性對比劑；按生物學(xué)分布分為細(xì)胞外間隙非特異性分布對比劑、血池分布對比劑和細(xì)胞特異性對比劑等。其中，以含釓的細(xì)胞外間隙非特異性分布對比劑的臨床應(yīng)用最多 [7]，現(xiàn)在，磁共振釓對比增強(qiáng)掃描已逐步成為全身多系統(tǒng)、多臟器的臨床常規(guī)檢查方法，有非常重要的臨床價(jià)值。 釓劑應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞外液對比劑， GDDTPA 化學(xué)名釓 二乙烯三胺五乙酸，商品名馬根維顯；細(xì)胞內(nèi)對比劑是以某一組織或器官的細(xì)胞作為靶來分布，對比劑迅速從血中廓清并與相關(guān)組織結(jié)合。如網(wǎng)織內(nèi)皮系統(tǒng)和肝細(xì)胞對比劑，優(yōu)點(diǎn)是使攝取對比劑組織和不攝取的組織之間產(chǎn)生對比。 利 用物理學(xué)上不同物質(zhì)在單位場強(qiáng)的磁場中產(chǎn)生磁化的能力表示。以此分為 : （ 1） 抗磁性物質(zhì)：磁化率為負(fù)值，其組成原子核外電子是成對的。人體內(nèi)大多數(shù)物質(zhì)和有機(jī)化合物屬于這類物質(zhì)。 徐州醫(yī)學(xué)院 2021 屆本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 2 頁 （ 2） 順磁性對比劑－由順磁性金屬元素組成，如 Gd， Mn 等。它們所含的外層電子是不成對的，故 具有較大的磁矩，磁化率也較大。外加磁場存在是，順磁性物質(zhì)中的原子偶極子的排列與磁場方向平行，從而具有磁性。一旦外加磁場移去或消失，其原子偶極子排列即呈隨機(jī)，則磁性消失。 （ 3） 超順磁性對比劑－由界于順磁性和鐵磁性之間的磁性微?；蚓w組成，這種粒子或晶體有磁疇組成。當(dāng)存在外加磁場影響時(shí)，聚集粒子或晶體中的每一粒也傾向于排列成序。由于這種粒子或晶體的磁矩相當(dāng)于成千上萬的電子磁矩，所以其磁性大于順磁性者，其磁化速度快于順磁性物質(zhì)。 （ 4） 鐵磁性對比劑：為具有磁矩而緊密排列的一組原子所組成的晶體。這樣緊密聚集的一組原子的直徑約 為 50nm，由于原子間的相互作用，是這些原子的磁矩排列有序，形成一個(gè)遠(yuǎn)大于單個(gè)原子磁矩的永久磁矩稱為磁疇。一次磁化后，即使在沒有外加磁場作用的情況下，鐵磁性物質(zhì)的磁疇也不是完全隨機(jī)排列，故仍帶一定磁性。 由于 釓、錳等某些金屬離子具有順磁性，弛豫時(shí)間長，磁矩較大，在磁共振成像中，順磁性物質(zhì)通過擴(kuò)散或旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)引起原子水平的局部磁場巨大波動(dòng)，這有利于受激勵(lì)質(zhì)子間的能量轉(zhuǎn)移，使得被激勵(lì)后的氫原子核的磁化矢量更快回到其初始狀態(tài)，縮短弛豫時(shí)間，圖像對比發(fā)生變化。 1984 年 Carr 首次采用釓噴酸葡胺 (GdDTPA)進(jìn) 行人體腦腫瘤的增強(qiáng)顯像研究。 1987 年 Gd— DTPA 作為 MRI 對比劑正式被美國食品和藥物管理局 (FDA)批準(zhǔn)，經(jīng)大量藥理和臨床應(yīng)用研究證明， GdDTPA 是一種安全、方便、增強(qiáng)效果良好的對比劑。近年來，對 MRI 對比劑的研究越來越廣泛，逐漸開始研究具有組織或器官靶向的對比劑，可應(yīng)用于全身所有器官和組織的檢查 [89]。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，有近 50%的 MRI 檢查已經(jīng)涉及使用 MRI 對比劑，以此來提高成像對比度，而這個(gè)比例還在不斷地?cái)U(kuò)大。磁共振對比劑根據(jù)其作用的原理可以分為2 種，即縱向弛豫（ T1）對比劑和橫向弛豫（ T2）對比 劑。 T1 對比劑以釓類有機(jī)化合物為主要研究對象，而 T2對比劑則以鐵類物質(zhì)為核心。小分子釓類對比劑能夠縮短水中質(zhì)子的 T1 時(shí)間，使得 T1 加權(quán)成像的亮度變大。但這類對比劑具有非特異性，體內(nèi)存留時(shí)間短，弛豫效能低且劑量大時(shí)可導(dǎo)致毒性反應(yīng)等缺點(diǎn)。近年來，已有很多研究者將釓對比劑制備成納米制劑對其進(jìn)行改進(jìn)，以達(dá)到水溶性好，選擇性好，體內(nèi)穩(wěn)定，弛豫效能高，毒性低且能夠完全被排出體外等目的。 釓類對比劑作為臨床最常用的磁共振對比劑，吸引了很多的研究人員對其進(jìn)行更深入的研究與改進(jìn)，釓類納米對比劑的研制與開發(fā)為 MRI 技術(shù)和臨床診 斷提供了更強(qiáng)有力的支撐，其在生物醫(yī)藥以及臨床上也有更廣闊的應(yīng)用前景。研制出生物相容性好，具有靶向性，低劑量，低毒性以及低成本的磁共振對比劑是研究者不斷追求的目標(biāo)。 研究目的及研究內(nèi)容 因?yàn)檠芯孔疃嗟亩喟范圄人犷愥徟浜衔铮缃?jīng)典的二亞乙基三胺五乙酸徐州醫(yī)學(xué)院 2021 屆本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 3 頁 (DTPA)、 1,4,7,10四氮雜環(huán)十二烷 1,4,7,10四乙酸 (DOTA)釓配合物。而這類小分子配合物的血液循環(huán)時(shí)間和在組織中的駐留時(shí)間較短，導(dǎo)致成像窗口時(shí)間縮短，信噪比降低，影響了其成像質(zhì)量和在臨床上的應(yīng)用，另外，小分子配合物的滲透壓較高，使得它們 具有一定的毒副作用 [10]。 磁性納米顆粒具有粒徑小、比表面積大、磁響應(yīng)性、超順磁性，高矯頑力、低居里溫度等特點(diǎn)被廣泛的應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。但由于納米顆粒較高的表面能，納米顆粒間容易發(fā)生團(tuán)聚，從而影響其穩(wěn)定性。同時(shí)納米顆粒本身并非機(jī)體自身物質(zhì)，容易被肝脾等巨噬細(xì)胞識(shí)別吞噬，難以在機(jī)體內(nèi)部長循環(huán)，這些都限制了磁性納米材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展 [11]。 本論文的研究目的是制備可用于磁共振成像對比的氧化錳納米粒子，研究的內(nèi)容是分別運(yùn)用兩步法合成水溶性 MnO NPs 和一步法合成 PEGMnO NPs。以此分為兩個(gè) 部分： 第一部分運(yùn)用 兩步法首先制備油錳復(fù)合物，分別用一水合檸檬酸、丁烷四羧酸和多巴胺將合成的油性氧化錳納米粒子相轉(zhuǎn)移成水溶性氧化錳納米粒子。由于該方法制備出的磁性納米粒子會(huì)發(fā)生團(tuán)聚和沉淀，得到的三種納米粒子的水溶性一水合檸檬酸 MnO多巴胺 MnO丁烷四羧酸 MnO，表明該材料合成的氧化錳納米粒子的水溶性效果并不是很理想，尚不能滿足生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用，而且通過磁共振性能測試發(fā)現(xiàn)該氧化錳納米粒子的成像對比效果 丁烷四羧酸 MnO多巴胺MnO一水合檸檬酸 MnO，但總體成對比效果不太明顯。 第二部分以聚乙二 醇 （ PEG） 作為溶劑和表面活性劑采用一步法加熱回流制備水溶性 PEGMnO NPs。通過水溶性測試說明由 1mmol、 3mmol 和 4mmol 四水合硝酸錳合成的 PEGMnO 的水溶性效果很理想，而且 MRI 性能測試表明PEGMnO NPs 具有較高的弛豫率，而由 4mmol 的四水合硝酸錳制備 PEGMnO的 弛豫率 最高， 為 。 通過傅里葉紅外光譜分析，說明 PEGMnO 納米粒子表面成功修飾上 PEG(COOH)2分子。經(jīng)過 MTT 測試說明在一定濃度內(nèi) PEGMnO納米粒子 對 7860 腎癌細(xì)胞的毒性較低，具有良好 的生物相容性，可作為 MRI對比劑用于腫瘤細(xì)胞的 MRI 診斷。 本論文的結(jié)構(gòu)和各章節(jié)的安排 論文第一章簡單介紹了本實(shí)驗(yàn)的研究背景，并簡單闡述了本文主要研究內(nèi)容。 論文第二章詳細(xì)介紹磁共振成像，包括原理結(jié)構(gòu)和臨床方面的技術(shù)應(yīng)用。 論文第三章詳對各類磁共振成像對比劑進(jìn)行詳細(xì)介紹及未來的展望。 論文第四章中制備油性氧化錳納米粒子，并對其磁共振信號(hào)響應(yīng)進(jìn)行檢測，得到滿意結(jié)果。 論文第五章采用兩步法配體交換制備氨基和羧基修飾的水溶性氧化錳納米粒子，并對其進(jìn)行磁共振響應(yīng)表征后得到最優(yōu)方案。 論文第六章將采用一步法制備 水溶性氧化錳納米粒子對比劑，利用含錳離子的四水合硝酸錳，溶解在 聚乙二醇二羧酸 中， 合成不同濃度表面含有特殊官能團(tuán)徐州醫(yī)學(xué)院 2021 屆本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 4 頁 的超順磁性納米對比劑，并通過傅里葉變換紅外光譜分析、磁共振信號(hào)響應(yīng)、 ICP等表征得出運(yùn)用 4 mmol 四水合硝酸錳合成 PEGMnO 的。 論文第七章將四水合硝酸錳與聚乙二醇二羧酸結(jié)合組裝成納米分子成像對比劑，作用于腫瘤細(xì)胞，檢測其細(xì)胞毒性的特點(diǎn)。結(jié)果顯示本論文所構(gòu)建的 PEGMnO納米分子成像對比劑可實(shí)現(xiàn) 7860 癌細(xì)胞的特異性 MRI 應(yīng)用。 論文第八章是總結(jié)與展望。 徐州醫(yī)學(xué)院 2021 屆本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 5 頁 2 磁共