【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 使未經(jīng)氨處理，但經(jīng)石灰中和處理的水解液的發(fā)酵性能得到很大的提高。 Lourdes 采用石灰乳將水解液由 ，再用磷酸回調(diào)至 ，然后用％的活性炭吸附處理， Candida guilliermondii 發(fā)酵最終木糖醇得率可以達(dá)到 79％，木糖化學(xué)化工 學(xué)院 化學(xué)工程與工藝 0601 班學(xué)生 馮其龍 課程設(shè)計(jì) 第 9 頁(yè) 共 24頁(yè) 濟(jì)南大學(xué)課程設(shè)計(jì)用紙 醇生產(chǎn)速率可達(dá)到 (Lh)。而對(duì)于木材水解液的發(fā)酵， Silva 等 人發(fā)現(xiàn)當(dāng)水解液先用石灰乳調(diào) pH 值到 ，再用磷酸調(diào) pH 值到 ，可以達(dá)到最大的木糖醇濃度 59g/L。此外，采用汽提法與真空濃縮法均可在提高水解液糖濃度的同時(shí)去除水解液中的有害物質(zhì)，提高水解液的發(fā)酵性能， Rodrigues 等 人利用真空濃縮方法降低水解液中抑制物濃度，提高發(fā)酵木糖醇得 率，最終木糖醇得率和濃度分別達(dá)到了 ％和 。 過(guò)程條件分析 目前，目前國(guó)內(nèi)外以純木糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中參數(shù)的優(yōu)化進(jìn)行了以下幾個(gè)方面研究： 溶氧 氧對(duì)酵母的生長(zhǎng)代謝十分重要，人們目前對(duì)木糖醇需氧代謝的生化和生理機(jī)理進(jìn)行了研究。這一機(jī)理說(shuō)明木糖醇需氧代謝和氧化磷酸化過(guò)程中糖的運(yùn)輸、輔酶的再生以及 ATP的生成均有關(guān)系。在好氧條件下，糖的消耗主要用于菌體的生長(zhǎng)，而在微好氧條件下大部分的木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇而酒精的產(chǎn)量很小。一些學(xué)者認(rèn)為，木糖代謝中木糖還原酶還原木糖 需要 NADPH，而木糖醇脫氫酶氧化木糖為木酮糖需要 NAD+，在微好氧的條件下， NADH過(guò)量產(chǎn)生，從而阻礙了木糖醇的氧化，促進(jìn)了木糖醇在發(fā)酵液中的 積累 。在搖瓶培養(yǎng)中裝液量和搖床轉(zhuǎn)速均會(huì)影響溶氧，對(duì)于上罐發(fā)酵來(lái)說(shuō)，影響溶氧的主要是通氣量和攪拌槳的轉(zhuǎn)速。對(duì)于 NRRL Y7426 的搖瓶培養(yǎng) (250mL 三角瓶中，裝液量 50mL)，在轉(zhuǎn)速100rpm時(shí)，木糖消耗很慢，木糖醇的產(chǎn)量也很低。而轉(zhuǎn)速提高到 300rpm時(shí)，木糖消耗很快，木糖醇的濃度可達(dá) 99． 67g/L。在轉(zhuǎn)速 200rpm時(shí)，木糖的消耗速 度雖然很慢，但木糖醇的濃度卻可以達(dá)到 113． 54g/L。 這是因?yàn)檗D(zhuǎn)速太高時(shí)，溶氧濃度大，木糖消耗用于細(xì)胞生長(zhǎng)的部分大。但轉(zhuǎn)速太低時(shí)，溶氧濃度太小 (厭氧環(huán)境 )，由于缺少 TCA途徑產(chǎn)生的 NADH和 NADPH，木糖的吸收無(wú)法進(jìn)行。 其他糖類(lèi) 葡萄糖的存在，是影響酵母發(fā)酵木糖生產(chǎn)木糖醇的一個(gè)關(guān)鍵因素。采 用 Candida parapsilosis 發(fā)酵 木糖和葡萄糖的混合液時(shí)，葡萄糖首先被消耗。這樣在木糖被利用前就有個(gè)延滯期以合成木糖代謝所必需的酶。葡萄糖含量低于 5g/L 時(shí)木糖醇的產(chǎn)量不會(huì)降低，因?yàn)榇藭r(shí)葡萄糖進(jìn) 行的是有氧代謝，不產(chǎn)生乙醇。而當(dāng)葡萄糖的濃度大于 5g/L 時(shí)，有氧代謝消耗不掉的部分便通過(guò)無(wú)氧代謝而產(chǎn)生乙醇，木糖醇的產(chǎn)量降低。這是因?yàn)槟咎巧赡咎谴己推咸烟巧梢掖嫉姆磻?yīng)均為氧化還原反應(yīng)，會(huì)形成競(jìng)爭(zhēng)氧化還原勢(shì)，所以當(dāng)葡萄糖超過(guò)一定的量，發(fā)生無(wú)氧代謝產(chǎn)生酒精時(shí)就會(huì)抑制木糖醇的生成。也有人認(rèn)為葡萄糖的存在可能會(huì)抑制將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇過(guò)程中的關(guān)鍵酶木糖還原酶的活力，從而導(dǎo)致木糖醇得率降低例。 Timothy 等利用類(lèi)似的兩階段發(fā)酵法來(lái)避免葡萄糖的抑制作用。 若添加比木糖更易于利用的糖類(lèi)作為碳源，阻抑木糖消耗于細(xì)胞生長(zhǎng) 及 NADH 再生，則木糖醇的實(shí)際轉(zhuǎn)化率有可能達(dá)到或超過(guò)理論轉(zhuǎn)化率。 Oh等在葡萄糖 /木糖為 lO％～ 20％條件下培養(yǎng) Candida tropicalisKFCC10960，木糖醇轉(zhuǎn)化超過(guò) ，當(dāng)葡萄糖比例超過(guò)化學(xué)化工 學(xué)院 化學(xué)工程與工藝 0601 班學(xué)生 馮其龍 課程設(shè)計(jì) 第 10 頁(yè) 共 24頁(yè) 濟(jì)南大學(xué)課程設(shè)計(jì)用紙 20％，會(huì)大量生成乙醇，嚴(yán)重降低木糖醇生成速率。 在術(shù)糖醇發(fā)酵過(guò)程中， 及 吸收利用葡萄糖、甘露糖、半乳糖的速率分別是木糖的 、 、 ，這些己糖主要用于酵母細(xì)胞生長(zhǎng)，一般不會(huì)積累相應(yīng)的多 元醇。 溫度 PH 值對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)代謝 都有很大的影響。雖然大多數(shù)酵母菌的適宜生長(zhǎng)溫度在2030℃，但研究表明，隨著溫度的上升，酵母轉(zhuǎn)化成木糖的能力有所提高，例如 Nurdan等人發(fā)現(xiàn) 在溫度從 22℃升到 36℃時(shí)產(chǎn)木糖醇的能力提高。 對(duì)于 NRRLY7426 的搖瓶培養(yǎng)，發(fā)酵溫度在 2837℃之間，木糖醇的產(chǎn)率基本穩(wěn)定，木糖消耗很快，木糖醇的產(chǎn)率高（約 100g/L） 。但超過(guò)這個(gè)限度，木糖的消耗很慢，木糖醇的產(chǎn)出很低（ ） 。對(duì)于 Candida ,溫度在 3445℃時(shí)，木糖醇的生產(chǎn)速率 均穩(wěn)定 ，但達(dá)到 45℃或更高時(shí)，發(fā)酵速率大大降低。 PH 值 PH 值對(duì)菌體代謝和產(chǎn)物生成均有很大影響，不同的酵母發(fā)酵最佳初始 PH 值不同。一般情況下，酵母適應(yīng)的 PH 值范圍是 ～ ，但不同的菌株也有差別，而且擦很難升木糖醇的最適 PH 也不盡相同。如管囊酵母在 PH 為 ～ 時(shí)得到最大產(chǎn)量的木糖醇 ，搖瓶培養(yǎng)，木糖發(fā)酵產(chǎn)木糖醇的最適 PH 在 到 之間，休哈塔假絲酵母產(chǎn)生 木糖醇的最適 PH 在 ～ 。 多數(shù)酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中 PH 值不斷下降，如 Kastner 等就注意到利用也蒙假絲酵母發(fā)酵木糖 48h 后，發(fā)酵液 PH降低 3 個(gè)單位。這是因?yàn)樵诖x過(guò)程中產(chǎn)生的酸性物質(zhì)造成的。 一些酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)對(duì) PH 要求不高，在 和 時(shí)均有相當(dāng)量的木糖醇產(chǎn)生。而對(duì)于 Candida bodinii 在 到 之間隨著 PH的升高，木糖醇的生成速度和轉(zhuǎn)化率均有升高。 底物濃度 在一定濃度范圍內(nèi)提高發(fā)酵培養(yǎng)基中木糖濃度，既有利于提高產(chǎn)物木糖醇的濃度，也有利于提高木糖醇得率和體積生產(chǎn)速率。 木糖消耗速率與木糖醇生成速率在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中呈線性關(guān)系，這表明可以通過(guò)提高初始木糖醇的濃度來(lái)增加木糖醇得率。 及 的 木 糖還原酶 (XR)活性顯著受到木 糖 濃度的影響，獲得最大產(chǎn)物生成速率及最大產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的木糖濃度，基本上位于木糖還原酶活性達(dá)到最大值的木糖濃度附近。 Candida tropicalis 在初始木糖濃度為 172 g/L 時(shí)，木糖醇得率最大，隨著木糖濃度的增加，木糖還原酶活性增大，而對(duì)木糖醇脫氫酶 (XDH)的影響不大。但是當(dāng)木糖濃度超過(guò) 300 g/L，滲透壓將影響木糖醇的產(chǎn)生，對(duì)此可以采取分批補(bǔ)料的方法予以消 除。 對(duì)于 NRRLY7426 的搖瓶培養(yǎng) (250mL 三角瓶中，裝液量 50mL，轉(zhuǎn)速化學(xué)化工 學(xué)院 化學(xué)工程與工藝 0601 班學(xué)生 馮其龍 課程設(shè)計(jì) 第 11 頁(yè) 共 24頁(yè) 濟(jì)南大學(xué)課程設(shè)計(jì)用紙 300rpm)，在初始木糖濃度低時(shí)，木糖可以迅速而有效地轉(zhuǎn)化為木糖醇。當(dāng)初始木糖濃度很高 ( 和 )時(shí)，由于高滲作用的影響木糖開(kāi)始時(shí)消耗速度較慢。木糖濃度因消耗而降低后，滲透壓減小，木糖的消耗速度迅速增加，最終木糖醇得率可以達(dá)到％和 ％ 。 在搖瓶培養(yǎng)時(shí) (裝液比 4/5， 150rpm)，隨著初始木糖濃度的增加木糖醇的產(chǎn)生速率也增加，木糖醇得率也是如此。 在搖瓶培養(yǎng) (裝液比2/5， 125rpm)時(shí)，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到 150g/L 時(shí)，木糖醇的產(chǎn)生速度和得率均最高，超過(guò)最佳底物濃度后這兩項(xiàng)指標(biāo)均迅速下降，出現(xiàn)了明顯的底物抑制現(xiàn)象。 氮源 木糖醇的積累受氮源的顯著影響。同樣氮源在不同培養(yǎng)基，不同酵母菌株之間存在很大差異。有機(jī)氮源可以降低 中的木糖醇脫氫酶水平， Dalliya 比較了四種不同的有機(jī)氮源，酵母粉的效果最佳。用稻草半纖維素水解物培養(yǎng) ，在 時(shí)用尿素作氮源比硫酸銨好，木糖醇轉(zhuǎn)化率提高 25％。而在 ，這兩種氮源差異明顯。此外，無(wú)機(jī)氮源如尿素和磷酸按也可以作為生產(chǎn)木糖醇的有效氮源。 工藝流程圖 化學(xué)化工 學(xué)院 化學(xué)工程與工藝 0601 班學(xué)生 馮其龍 課程設(shè)計(jì) 第 12 頁(yè) 共 24頁(yè) 濟(jì)南大學(xué)課程設(shè)計(jì)用紙 果 蔬粉 碎固 液 提 取 物分 離抽 提富 含 木 糖 醇 植 物水 解 （ 酸 催 化 劑 ）提 純催 化 氫 化 脫 毒分 離 提 純木 糖 醇商 品 木 糖 醇溶 解加 入 輔 料生 物 轉(zhuǎn) 化 （ 酶 、 微 生 物 ） 圖 木糖醇生產(chǎn)的工藝流程 木糖醇結(jié)晶動(dòng)力學(xué)分析 采用木糖催化加氫法生產(chǎn)木糖醇時(shí)，因?yàn)殒嚉浯呋瘎?duì)原料中木糖純度要求很高，所以木糖醇產(chǎn)物中的雜質(zhì)含量較少，采用常規(guī)結(jié)晶方法即能從木糖醇母液中結(jié)晶出木糖醇晶體。而采用微生 物發(fā)酵法制備木糖醇，由于發(fā)酵液組成復(fù)雜，產(chǎn)物中木糖醇含量相對(duì)較低，采用活性炭脫色、離子交換樹(shù)脂吸附等方法盡管可以除去發(fā)酵液中大部分雜質(zhì)，但少量殘留雜質(zhì)可能會(huì)對(duì)木糖醇結(jié)晶過(guò)程造成不同程度的影響。目前國(guó)內(nèi)外在這方面研究報(bào)道很少，從發(fā)酵液中結(jié)晶制備木糖醇目前還處于探索階段，至今沒(méi)有取得突破性進(jìn)展。 針對(duì)這些特點(diǎn)，對(duì)木糖醇結(jié)晶進(jìn)程中主要特征進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，并在此基礎(chǔ)上，考察了發(fā)酵液中殘?zhí)堑纫蜃訉?duì)木糖醇結(jié)晶動(dòng)力學(xué)的影響，得到了適宜的木糖醇結(jié)晶工藝參數(shù)。 過(guò)飽和木糖醇發(fā)酵液的制備 經(jīng)活性炭脫色和離子交換樹(shù)脂 脫鹽凈化處理后的木糖醉發(fā)酵液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (RE 化學(xué)化工 學(xué)院 化學(xué)工程與工藝 0601 班學(xué)生 馮其龍 課程設(shè)計(jì) 第 13 頁(yè) 共 24頁(yè) 濟(jì)南大學(xué)課程設(shè)計(jì)用紙 5298 上海亞榮生化儀器廠 )中，蒸發(fā)濃縮發(fā)酵液中木糖醇濃度至一定值。 木糖醇發(fā)酵液結(jié)晶 在 250 mL 結(jié)晶容器中加入 100mL 木糖醇飽和溶液或濃縮后的木糖醇發(fā)酵液，在一定條件下結(jié)晶特定時(shí)間，待結(jié)晶完畢，木糖醇母液 2500 rpm 離心 5 min， 過(guò)濾得到木糖醇晶體。木糖醇晶體溶于純凈水中， HPLC 法測(cè)定晶體離心中木糖醇純度。 木糖醇發(fā)酵液真空濃縮 木糖醇在常溫 (250℃ )下溶解度很大，約為 65g/100g 水。經(jīng)活性炭脫色和離子交換樹(shù)脂 脫鹽凈化處理后的木糖醇發(fā)酵液中，木糖醇濃度約為 g/L，這還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有達(dá)到木糖醇溶液的飽和狀態(tài)，所以必須對(duì)木糖醇發(fā)酵液進(jìn)行濃縮。木糖醇發(fā)酵液濃縮前后成分變化見(jiàn)表 所示 ： 表 木糖醇發(fā)酵液濃縮前后成分變化表 試驗(yàn) 濃縮溫度 (℃ ) 濃縮后木糖醇 (g/L) 濃縮后殘?zhí)菨舛?g/L) 殘?zhí)菗p失率 (%) 1 60 450 0 2 60 600 0 3 60 750 0 4 60 900 0 5 70 450 0 6 70 600 0 7 70 750 0 8 70 900 0 9 80 450 0 10 80 600 11 80 750 12 80 900 表 結(jié)果表明，在 70℃溫度下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮發(fā)酵液，發(fā)酵液中的木糖醇和殘?zhí)菨舛韧壤黾印５绻岣邼饪s溫度到 80℃以上，木糖醇發(fā)酵液色澤加深，這不利于木糖醇發(fā)酵液下一步結(jié)晶，所以采用 70℃下蒸發(fā)濃縮木糖醇發(fā)酵液較為適宜。 晶種 對(duì)木糖醇結(jié)晶的影響 由圖 a 可知，在