【文章內容簡介】 細胞物質的抽提及組織的腫脹 。 過高的濃度易毀壞酶的活性及細胞的精細結構 。 特別是鋨酸和高錳酸鉀 ， 高濃度會造成蛋白質分子的斷裂 。 戊二醛常用濃度為 1％ 6％ ， 鋨酸 1％ 2％ 。 含水較多的組織 ，一般需要較高的固定濃度 。 4． 固定的時間 、 溫度和樣品塊的大小 在任何情況下不管使用何種固定劑，都應在溫度較低的情況下進行。當前采用的標準固定時間是 1－ 4小時，固定溫度 為 0～4℃ 。由于組織樣品是由表及里逐層固定的，存在著固定的梯度，所以樣品的大小，直接關系到固定的均勻性 .“ 小”的樣品是實現(xiàn)均勻固定的最重要的條件。由于大多數固定劑，其穿透力每小時僅有 ～ ，所以在固定取材時， ～ mm3 應該是較理想的電鏡樣品尺寸。 第四節(jié) 漂洗與脫水 前后固定之間的漂洗，固定后脫水前的漂洗。 對大多數樣品，通常用與配制固定液相應的緩沖液漂洗組織 23次，時間 1h左右。植物或骨組織需要較長時間漂洗。脫水前的漂洗時間可短些。 脫水是指將組織內所含的游離水完全清除的過程，屬于包埋前必經步驟。 現(xiàn)在常用的包埋劑大都是非水溶性樹脂，因此只有將生物樣品中的游離水驅除干凈，才能保證包埋劑完全深入生物樣品內。 如果含有水分的生物樣品進入電鏡的高真空中，樣品就會急驟收縮并放出水蒸氣，這樣就會使電鏡的高真空遭到損壞，并且造成鏡筒的污染。 常用的脫水劑為乙醇和丙酮 。 它們是既能與水相混溶 ， 又能與包埋劑相混溶的有機溶劑 。 脫水過程宜緩和而有序地進行 ，原因是在脫水時組織內的水分和細胞內某些物質將被有機溶劑所抽提取代；若脫水急驟 ， 常易引起組織塊中滲透壓等條件的劇烈變化 ， 樣品出現(xiàn)猛烈收縮 ， 會導致樣品結構的破壞 。 因此 ，要求脫水時必須逐級提高有機溶劑的濃度 ， 而且每一級脫水的時間不應過長 ， 一般以 10～ 15分鐘為宜 。 具體的脫水程序為： ? 50％ 乙醇或丙酮 10～ 15分鐘 ? 70％ 乙醇或丙酮 10～ 15分鐘 （ 可置 4℃ 冰箱內過夜 ） ? 80％ 乙醇或丙酮 10～ 15分 ? 90％ 乙醇或丙酮 10～ 15分鐘 ? 95％ 乙醇或丙酮 10～ 15分鐘 ? 100％ 乙醇或丙酮 2次 ， 每次 30分鐘 。 ? 游離和培養(yǎng)細胞的脫水時間可適當縮短 。 ? 脫水時的注意事項 1． 脫水一定要徹底 ， 特別是 100％ 乙醇或丙酮應絕對保證無水 ，為此可事先加入吸水劑 （ 如無水硫酸鈉 、 無水硫酸銅等 ） 進行吸水處理 。 2． 如果當天完不成浸透 、 包埋操作時 ， 應將樣品停留在 4℃ 70％脫水劑中保存過夜 ， 因為一般認為 70％ 的濃度時所引起的組織塊體積變化最小 。 高濃度的脫水劑 、 尤其 100％ 脫水劑中決不可停留過夜 、 不僅可引起組織內過多物質被抽提 ， 而且會使組織塊發(fā)脆造成切片困難 。 3． 脫水操作時 ， 動作要盡量迅速 ， 特別是 100％ 脫水劑時 ， 更要注意樣品塊不要在空氣中停留時間過長 ， 否則會造成樣品干燥 ，使樣品內產生小氣泡致使包埋劑難以浸透 。 潮濕季節(jié)在空氣中暴露時間過長也會吸水受潮 。 第五節(jié) 浸透與包埋 、 包埋的目的要求 ? 經過脫水處理后的樣品 ， 即可用包埋劑進行浸透 ， 其目的是用包埋劑逐步取代樣品中的脫水劑 ， 使細胞內外所有空隙都被包埋劑所填充 。在聚合過程中 ， 包埋劑已由單體聚合成高分子物質 ， 使樣品內的各種結構得到堅固的支持 ， 可承受超薄切片的切割和耐受電子束的轟擊 。包埋塊的硬度和彈性應該適中 ， 而且其中不能夾有氣泡 ， 否則切片易于變形 ， 很難得到理想的切片 。 由此可見 ， 浸透與包埋的好壞 ， 是超薄切片成敗的關鍵之一 。 ? 為了確保浸透與包埋的質量 ， 選擇好適當的包埋劑是十分必要的 。 理想的包埋劑應該具備以下條件： ① 能與脫水劑 （ 乙醇 、 丙酮等 ） 完全混溶； ② 粘度低 、 易操作 、 而且易于滲入樣品內部； ③ 聚合后質地均勻 ， 體積變化小 。 能耐受電于束的照射與轟擊； ④ 在浸透包埋過程中 ，對細胞成分抽提少 ， 可保存其微細結構； ⑤ 在電鏡高倍放大下 ， 不顯示包埋劑本身的任何微細結構； ⑥ 包埋后具有良好的切片性能 ， 包括均勻性 、 可塑性 ， 硬度和彈性等； ⑦ 對人體無毒害作用 ， 且材料來源豐富 ， 操作簡便 ， 價格便宜 。 環(huán)氧樹脂類：這是當前采用最多的包埋劑 。 它具有三維交聯(lián)結構 ，包埋后可保存細胞內的微細結構 ， 對組織損傷小 ， 聚合后體積收縮率低 （ 僅有 2％ 左右 ） ， 耐受電子束轟擊性能好 。 其缺點是粘度較大 ， 操作不便 、 切片較為困難 ， 而且反差較弱 。 包埋塊切片時的難易 ， 與樹脂 、 固化劑 、 增塑劑及催化劑之間的比例有關 ， 而且還取決于聚合的溫度 、 時間等因素 。 ? Epon812（低黏度環(huán)氧樹脂， 60℃ 20hour 以上） ? Spurr（低黏度環(huán)氧樹脂， 70 ℃ ， 8hour） ? 國產 618（黏度大， 60 ℃ ， 48hour） ? 單體 Epon812 ? 固化劑（或稱硬化劑） 有十二烷基琥珀酸酐（簡稱DDSA）、六甲酸酐（簡稱 MNA）等，它們參與樹脂三維聚合中的交聯(lián)反應，并被吸收到樹脂鏈中。 ? 增塑劑（不是必需的） 鄰苯二甲酸二丁酯（簡稱DBP）．其主要作用是提高包埋塊的彈性和韌性，改善其切割性能。 ? 催化劑 －三（二甲氨基甲基苯酚）簡稱為 DMP－其主要作用是可以催化聚合反應，但本身并不加入到樹脂鏈中。 ? 配方： A液 Epon812 10ml B液 Epon812 10ml DDSA 16ml MNA 水溶性包埋劑：是進行細胞化學研究較理想的包埋劑 ， 由于這種包埋劑呈水溶性 ， 所以組織標本可以在水洗后直接投入包埋劑中 ， 避免因使用乙醇 、 丙酮等脫水劑對樣品成分的抽提 ， 同時也避免組織內酶活性的降低 、 破壞和人為擴散 。 另外 ， 水溶性包埋劑可以在較低溫度的紫外線照射下進行聚合 ， 避免了一般包埋劑必須在高溫下聚合而給酶活性帶來的破壞 ， 所以是酶活性定位和定量研究十分優(yōu)良的包埋劑 。 如乙二醇甲基丙烯酸脂 （ 簡稱GMA） 、 K4M等 。 浸透為了使包埋劑均勻地滲入樣品內 ， 脫水后的樣品應經過逐級浸透的過程 。 ? 浸透的具體過程為：脫水后樣品迅速移入丙酮 、 包埋劑等量混合液 ， 30分鐘或數小時 。 然后入純包埋劑數小時或過夜 ， 最后再進行包埋 ， 另外 ， 亦有用環(huán)氧丙烷作過渡溶劑 ， 其浸透程序為：脫水后樣品 → 丙酮 、環(huán)氧丙烷等量混合液 （ 15分鐘 ） → 環(huán)氧丙烷 （ 2次 ，各 15分鐘 ） → 環(huán)氧丙烷 、 包埋劑等量混合液 （ 數小時 ）→ 純包埋劑 （ 數小時 ） → 包埋 。 包埋 常規(guī)包埋法：一般包埋可在藥用膠囊或特制的錐形薄塑料管內進行 ， 近些年來大都采用特制的多孔 （ 錐形 ）橡膠或硅膠包埋板 。 常規(guī)包埋的具體做法，在包埋前先將包埋板放入60℃ 干燥箱烘干 2小時左右，用吸管吸取配好的包埋劑灌滿膠囊或包埋板，在其一側放入用硫酸紙寫好的樣品標簽小紙條（包括課題號、日期、包埋塊號別等），再用牙簽挑起組織塊，放入上述膠囊中央，靜放數小時后樣品會自然下落到底部。然后將上述包埋板放入恒溫箱內加溫聚合。加溫時先入 37℃ ～ 45℃ （ 24小時），而后60℃ 恒溫箱（ 24小時）。如直接以 60℃ 恒溫箱加溫聚合48小時亦可。 VHIC ? 浸透 、 包埋用注射器 、 吸管 、 燒杯 、 膠囊 、 牙簽及其它器皿 ， 均應在用前烘干 ， 不能有任何水分；用后要及時清洗盛過包埋劑的容器 ， 否則樹脂固化后難以清洗 。 清洗時先用廢紙擦凈剩余的包埋劑 ， 而后再用丙酮洗凈 。 ? 所用藥品均應注意防潮 ， 藥品應在干燥器中存放或在冰箱里保存 。 但從冰箱中取出的藥品必須等到恢復至室溫時才允許打開蓋子 ， 否則水分會進入藥品內 。 ? 包埋時動作要輕巧 ， 避免產生氣泡影響切片 。 ? 操作時皮膚切勿接觸包埋劑 ， 以防引起皮炎 ， 有的包埋劑有致癌作用 ， 應注意防護 。 ? 制好的包埋塊應放在帶蓋的小瓶里 ， 存放在干燥器中 ，以防止包埋塊吸潮變軟影響切片 。 第六節(jié) 超薄切片 超薄切片是將固化的包埋塊在超薄切片機上切為薄片的過程 （ 厚度約為 50nm） ， 它是整個制樣程序的中心環(huán)節(jié) 。 超薄切片的好壞與切片機的性能 、 切片刀的質量 、包埋塊的切割性能以及操作者的技術經驗等因素密切相關 。 當進行超薄切片前 ， 必須做好一切準備工作 ， 如制備支持膜 、 制備玻璃刀 、 修整包埋塊等 ， 開始切片時必須心境平穩(wěn) ， 精力集中 ， 避免任何干擾 （ 如隨意離位 、各種振動 、 人員往來 、 塵粒污染等 ） 。 一 、 選擇與清洗載網 ? 超薄切片的操作過程與石蠟切片基本相似 ， 但承載切片的不是載玻片 ， 而是具有透明支持膜的圓形銅網 ，特殊切片還需用鎳網 、 不銹鋼網或銀絲網 。 銅網大都以電解法制成 ， 直徑 3mm（ 少數為 2mm） ， 網孔的形狀有園形 、 方形 、 單孔形 、 狹縫形等 ， 網孔的數目有50～ 400目多種規(guī)格 。 ? 超薄切片時一般選用 200目銅網 ， 網孔大者觀察的有效面積亦大 ， 但其對切片的支持穩(wěn)定性能較差 。 因此如果觀察分辨率要求高的樣品時 ， 則選用 200目以上的銅網 ， 以增強樣品的穩(wěn)定性能 。 銅網的洗滌處理因新舊而有不同 ， 方法如下： 1． 新銅網 可先用丙酮清洗數遍 ， 而后再以無水乙醇清洗幾次 ， 待干燥后使用 。 清洗的目的是去除銅網上的油污 ， 以便支持膜與銅網得以牢固的貼附 。 2． 舊銅網 凡使用過的銅網 ， 均可經下法清洗以后 ，重復使用： ? （ 1） 酸洗法：放入盛有濃硫酸的小燒杯或錐形瓶內輕輕搖動 ， 約經 1～ 3分鐘后即可清洗干凈 。 倒出硫酸 ，水洗數次后 ， 再用氨水清洗一次 ， 用蒸餾水反復洗滌數次 。 最后在無水乙醇或丙酮內清洗兩遍 ， 取出平鋪于濾紙上自然涼干待用 。 ? （ 2） 超聲清洗法：先將舊銅網放入小燒杯內 ， 以醋酸異戊酯或二氯乙烷溶去火棉膠膜和 Formavar膜 ， 浸泡時間約半小時 。 然后再放入盛有 95％ 乙醇或丙酮的小燒杯內 ， 將超聲波探頭插入其內超聲清洗 ， 時間約5～ 10分鐘 ， 超聲波頻率 8Hz。 二 、 制備支持膜 取清洗干凈的銅網 ， 向它的表面制備一層透明而無結構的支持膜 ， 以便承載有關的切片樣品 。 此膜宜薄厚適中 ， 過薄時樣品易有漂移或被電子束打破 ， 過厚時則降低圖像的分辨力 ， 一般厚度約為 20nm。 用做支持膜的原料有 Formvar、 火棉膠和噴碳等 。 1． Formvar膜 該膜的化學成分為聚乙烯醇縮甲醛 （ Polyvinyl formal， 簡稱 PVF） 。 首先制備 %的氯仿 （ 或二氯乙烯 ） 溶液 ， 然后用洗凈的玻璃片伸入到該溶液中停留片刻 ， 平穩(wěn)取出 ，自然干燥后玻片上形成一層薄膜 ， 再用刀片沿玻片邊緣將膜劃破 ，繼將該玻片的一端浸入玻璃平皿的蒸餾水中 ， 待玻片上的薄膜完全漂在水面 ， 把玻片輕輕下壓取出 。 再將銅網排列在膜上 ， 用濾紙與銅網完全貼附后 ， 用鑷子夾住濾紙的一角輕輕將其取出放于培養(yǎng)皿中 ， 待自然干燥后使用 。 制膜時玻璃片一定要光潔干凈 ， 否則 Formvar膜不能從玻片上脫落飄起；制膜時室內濕度不能太大 （ ＜ 60％ ） ， 否則易在膜上出現(xiàn)微孔；另外 ， 溶劑中不能混有水分與雜質 ， 操作時應注意防止 ， 否則膜上會有許多斑點 。 Formvar膜具有良好的透明度與機械強度 ， 不易被電子束擊破 ， 因此為當前電鏡制樣最普遍采用的支持膜 。 2． 火棉膠膜 常用 1～ 2％ 火棉膠醋酸異戊酯溶液 。 取市售的 6％ 火棉膠溶液 ， 加入等量的醋酸異戊酯 ， 即成 3％ 溶液 。 制膜時先取直徑 9～ 12cm的培養(yǎng)皿 ， 盛滿雙重蒸餾水 ， 在水面上輕輕滴 1～ 2滴上述溶液 ， 醋酸異戊酯很快揮發(fā)后 ， 即可在水面上形成一層均勻的火棉膠薄膜 。 此時將洗凈的銅網排列在膜上 ， 然后在銅網上放上一張濾紙 ， 待濾紙浸濕后輕輕提起 ， 將貼有銅網的濾紙取出水面 ， 放于培養(yǎng)皿中 ， 在 50～60℃ 溫箱中烘干待用 。 3． 碳膜的機械強度和化學穩(wěn)定性能均優(yōu)于其它支持膜 ， 因此多用來觀察高分辨樣品 。 其制作方法如下：取此直徑為 3或 5mm的兩根碳棒 ， 一根作固定極 ， 將頂端磨平 ， 另一極作推進極 ， 將一端磨成細尖 。 取上述磨制好的碳棒裝在真空噴鍍儀的電極柱上 ， 使推進極的尖端與固定極的平端