原核基因表達(dá)及其調(diào)控(編輯修改稿)
2025-06-17 13:26 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 質(zhì)粒載體 pPL?結(jié)構(gòu)示意圖 （三）提高蛋白質(zhì)的表達(dá)量 某些表達(dá)載體被構(gòu)建用于增加蛋白質(zhì)的表達(dá)量，例如，pPLc2833 : （ 1）強(qiáng)啟動(dòng)子； （ 2）選擇性標(biāo)記； （ 3）多克隆位點(diǎn)（ MCS） 其衍生質(zhì)粒 pCP3的構(gòu)建：將 pPLc2833的復(fù)制起始位點(diǎn)替換為另一個(gè)質(zhì)粒 pKN402。 質(zhì)粒 pKN402的復(fù)制起始位點(diǎn)是耐溫型的，在 42?C時(shí)仍然有很強(qiáng)的復(fù)制起始的功能。 電泳后回收片段 c 電泳后回收片段 1和 3 連接 由于 pKN402和 pCP3的復(fù)制子在 42?C時(shí)仍然具有很強(qiáng)的起始復(fù)制能力，因此當(dāng)培養(yǎng)溫度升高到 42?C時(shí)，細(xì)胞中的pKN402和 pCP3的拷貝數(shù)要比 pPLc2833高 5～ 10倍。 溫度對(duì) 3種表達(dá)載體質(zhì)?？截悢?shù)的影響 （四）大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng) 小規(guī)模培養(yǎng)（ 1～ 5L）含表達(dá)載體的重組菌株時(shí)，其調(diào)控可以直接向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物，或者升高溫度，但是在半工業(yè)化（ 20～200L）或者工業(yè)化大規(guī)模（大于 200L）生產(chǎn)時(shí)，不能采用小規(guī)模的方法： （ 1）直接向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物如 IPTG，由于需要量較大，成本 高，不經(jīng)濟(jì)； （ 2）即使是使用溫度敏感的表達(dá)載體，升高溫度既需要較長(zhǎng)的時(shí) 間，又需要很大的能源消耗，成本也很高。 一種解決的途徑：使用 “ 雙質(zhì)粒系統(tǒng) ” ：用 trp啟動(dòng)子帶動(dòng)編碼 cI阻遏蛋白的基因，然后將它們置于一個(gè)弱啟動(dòng)子的載體上；將要表達(dá)的外源基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子 PL之下，使其受 PL啟動(dòng)子的控制。 “雙載體系統(tǒng)”特點(diǎn)： 1）當(dāng)培養(yǎng)基中 Trp含量較低時(shí)， trp啟動(dòng)子啟動(dòng)， cI阻遏蛋白合成，此時(shí) PL啟動(dòng)子受阻遏，目的基因不表達(dá)； 2）添加 Trp（可添加蛋白胨）以后， trp啟動(dòng)子受阻遏，而 PL啟動(dòng)子啟動(dòng)，此時(shí)可表達(dá)外源蛋白 。 A 培養(yǎng)基中不存在色氨酸 B 培養(yǎng)基中不存在色氨酸 cI蛋白合成 （脫阻遏） 無(wú)克隆基因蛋白 合成（阻遏） 克隆基 因蛋白 合成 （脫阻遏 ） cI蛋白不合成 （阻遏） （五）在其它微生物中的表達(dá) 除了 E. coli以外，有些微生物也可以用作表達(dá)外源蛋白的宿主菌（受體菌）。 ?半乳糖苷酶在不同受體菌中的表達(dá)： 攜帶包含大腸桿菌 lacZ 基因和異源啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體的不同革蘭氏陰性菌受體菌中測(cè)定的 ? 半乳糖苷酶活性 ? G al acto sidas e a cti vity (U) in : Promoter Escher ichia coli Rh i zobium melil oti Rh i zobium legumi no s arum Pseud omo na s pu ti d a None 16 110 130 150 Nm 1,40 0 21 , 800 13 , 900 16 , 300 lac 2,00 0 9,05 0 6,25 0 9,80 0 tac 11 , 300 2,85 0 1,15 0 2,95 0 S1 40 3,30 0 1,20 0 3,35 0 苜蓿根瘤菌 豌豆根瘤菌 惡臭假單胞菌 大腸桿菌 ?半乳糖苷酶在不同受體菌中的表達(dá)分析： (1) 所有啟動(dòng)子在受體菌中都有一定的活性； (2) tac啟動(dòng)子在大腸桿菌中活性最高，但是在其它受體菌中活性最低； (3) 新霉素基因啟動(dòng)子（ Nm）是在大腸桿菌中活性最低的啟動(dòng)子，但是在其它受體菌中驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的活性卻最高。 chloramphenicol acetyltransferase （氯霉素轉(zhuǎn)乙?；福? ?galactosidase （ ?半乳糖苷酶 ） 其有效表達(dá)可在產(chǎn)堿桿菌（ Alcaligens sp.） , E. coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas stutzeri, 熒光假單胞菌 （ Pseudomonas fluorescens） , 和粘質(zhì)沙雷氏菌（ Serratia marcescens）觀察到 . 在革蘭氏陰性菌中通用的表達(dá)載體： pAV10 (1) 將轉(zhuǎn)座子 Tn5的一個(gè)末端倒置重復(fù)序列的 70bp插入到一個(gè)廣宿 主的、低拷貝數(shù)質(zhì)粒 pRK290的 MCS中所得； (2) 其 Tn5 DNA中含有 2個(gè)獨(dú)立的、但序列有部分重疊的啟動(dòng)子， 每個(gè)啟動(dòng)子分別調(diào)控一個(gè) Tn5基因的轉(zhuǎn)錄，因此該載體在許多 革蘭氏陰性菌中都起作用。 該載體含有四環(huán)素抗性基因 (Tetr), 1個(gè) BglII 酶切位點(diǎn)，質(zhì)粒復(fù)制子，啟動(dòng)子和 1個(gè)多克隆位點(diǎn)（ a multiple cloning sequence， MCS)。 廣 宿 主 載 體 （六）非融合蛋白的表達(dá) 指所表達(dá)的外源蛋白的 N末端不含有其它任何氨基酸，因此要求其翻譯起始位點(diǎn) ATG必須要位于其基因的 5’端。 表達(dá)非融合蛋白，一般要求其編碼基因的 ATG起始位點(diǎn)與核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ RBS）之間的距離要合適，否則即使僅相差 2~3個(gè) bp，表達(dá)效率也會(huì)大受影響。 RBS－ ATG最適距離的篩選： （ 1）在 ATG上游約 100 bp處尋找 1個(gè)酶切位點(diǎn)，進(jìn)行酶切； （ 2）再用核酸外切酶 III（ ExoIII）從該酶切位點(diǎn)開(kāi)始，部分消化以上酶切片斷，得到不同長(zhǎng)度的消化片斷； （ 3）將各消化片斷與含有啟動(dòng)子序列和 RBS序列的載體連接，構(gòu)建成系列可表達(dá)的重組基因，導(dǎo)入受體菌進(jìn)行表達(dá)量分析，從中篩選到最適的 RBSATG距離。 （ 4）構(gòu)建融合蛋白。 表達(dá)非融合蛋白的優(yōu)勢(shì)： 單基因產(chǎn)物，不受其它蛋白質(zhì)成分的干擾，有利于其展現(xiàn)完整功能和保持活性。 不利方面： 容易受到受體菌蛋白酶的降解，產(chǎn)量較低。 克服的方法： （ 1）用蛋白酶活性低的菌株作為受體菌。如枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis）蛋白酶活性強(qiáng)，而且具有外分泌性，但短芽孢桿菌（ Bacillus brevis）的蛋白酶活性就低得多； （ 2）用黃嘌呤營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株（ Ion－ ）作為受體菌。 Ion為 E. coli合成蛋白酶的主要底物。 （ 3）用蛋白酶抑制劑。如 T4噬菌體的 pin基因產(chǎn)物?？梢詫?pin同時(shí)克隆到質(zhì)粒載體上。 （七）融合蛋白的表達(dá)及純化 指所表達(dá)的外源蛋白與一種宿主蛋白共價(jià)連接，構(gòu)成融合蛋白。 融合蛋白的表達(dá) 1. “三夾板”式融合 2. 3. C末端融合 N末端融合 運(yùn)載蛋白 運(yùn)載蛋白 異源功
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