【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 示葉綠素 a和 b的濃度； Cx 表示類胡羅卜素的總濃度； D665 、D64 D470 表示葉綠體色素提取液在波長(zhǎng) 665nm、 649nm 和 470nm 下的 OD 值。 步驟： 分別選取以上材料各 5株，每株采摘中部葉片各一片，去掉兩端和葉脈，剪成 2mm 左右的細(xì)絲混 勻，用電子天平精確稱量 放入 25mL 具塞刻度試管中（每個(gè)材料三次重復(fù)），加入 15mL95%的乙醇，置于 4℃的冰箱中浸提，期間貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 8 頁(yè) 搖晃 3至 4次，直至葉片全部變白，表明葉綠素已被浸提干凈，然后將浸提液定容到 25ml。以 95%乙醇為空白對(duì)照，用分光光度計(jì)分別測(cè)定波長(zhǎng)在 665nm、 649nm和 470nm 下的 OD值。按公式分別計(jì)算葉綠素 a、 b和類胡蘿卜素的濃度（ ）及葉綠素總濃度。求得色素的總濃度后再按以下公式計(jì)算組織中各色素的含量（鄒琪， 20xx）。 樣品鮮重（或干重） 稀釋倍數(shù)）提取液體積（）色素濃度（葉綠素色素含量 ??? mlC 化學(xué)成分的測(cè)定 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)材料與農(nóng)藝性狀測(cè)定相同， 供試材料為 K32黃葉突變體、 K326 黃葉突變體的花藥培養(yǎng)所獲得的 DH 系（ H H8）、黃葉 k326 ( K326 黃葉突變體 K326 BC4 F3)， 以 K326 作對(duì)照。、 試驗(yàn)方法 于煙株團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期、現(xiàn)蕾期、成熟期，選取中部 3 片葉，每個(gè)材料 10株。去除表面污漬、抽去主脈后，將葉片剪成碎塊放入烘干箱內(nèi)， 105℃殺青、60℃烘干、粉碎過(guò) 40目篩 ,裝入自封袋中以備化學(xué)成分分 析， 同樣選取烤后的中部 3 片煙葉，去除表面污漬、抽去主脈后，將葉片剪成碎塊放入烘干箱內(nèi)， 60℃烘干、粉碎過(guò) 40目篩 ,裝入自封袋中以備成分分析。 分析項(xiàng)目分別為全氮含量、全磷含量、全鉀含量、總糖含量、煙堿含量及蛋白質(zhì)含量。 （ 1）全氮采用過(guò)氧化氫 硫酸消化法 （一）消化 準(zhǔn)確稱取磨細(xì)混勻的煙樣 裝入 100ml 準(zhǔn)備好的凱氏燒瓶底部，標(biāo)號(hào)。樣品要加到燒瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶莖上。加少量水使之濕潤(rùn)，再依次加濃硫酸 ，混合濕潤(rùn)后慢慢地加熱至開(kāi)始冒出大量白煙，微沸約 5分鐘繼續(xù)加熱微沸 25分鐘，取下稍放冷， 逐滴加入 30%過(guò)氧化氫 。作 1個(gè)空白對(duì)照，用以測(cè)定試劑中可能含有的微量含氮物質(zhì)，對(duì)樣品測(cè)定進(jìn)行校正。 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 9 頁(yè) （二）蒸餾和吸收 蒸餾和吸收是在微量凱氏定氮儀內(nèi)進(jìn)行的。凱氏定氮蒸餾裝置種類甚多，大體上都由蒸氣發(fā)生、氨的蒸餾和氨的吸收三部分組成。 （三）滴定 樣品和空白蒸餾完畢后，一起進(jìn)行滴定。含氮量運(yùn)用下列公式計(jì)算： 含水率）（ 取用倍數(shù)煙葉中的全氮 1W ???? NV 注：式中 NV 標(biāo)準(zhǔn)酸溶液的濃度 (mol/L)； W 試樣重量 (克 )； 每毫摩爾氮的克數(shù)。 （ 2） 全磷含 量的測(cè)定：礬鋁黃比色法。 吸取上述測(cè) N 的消化待測(cè)原液 10ml 于 50ml 容量瓶中，加兩滴二硝基酚指示劑，用 NaOH 中和至剛呈黃色，加入 10ml 釩鉬酸銨試劑，用水定容搖勻。 15 分鐘后在分光光度計(jì)波長(zhǎng) 440nm 處和 2cm 光徑的比色槽進(jìn)行比色測(cè)定，以空白溶液調(diào)節(jié)吸收值的零點(diǎn)。結(jié)果計(jì)算如下： 106*1* 100***ppmP% 含水率）（樣品重 分取倍數(shù)比色體積? （ 3） 全鉀含量的測(cè)定：火焰光度法。 吸取上述 N、 P的消化待測(cè)液 5ml 于 100ml 容量瓶中，用水定容 搖勻，直接在火焰光度計(jì)上測(cè)定，記錄檢流計(jì)的讀數(shù)，然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得待測(cè)液的鉀的濃度。 結(jié)果計(jì)算如下： 1061 100ppmK% ??? ???? 含水率）（樣品重 分取倍數(shù)測(cè)讀液體積 注：式中 ppm— 從工作曲線查得溶液中 K 的 ppm數(shù)；分取倍數(shù) — 待測(cè)液體積 /測(cè)讀液體積； 106— 將 ug換算成 g 的除數(shù)。 （ 4） 煙堿含量的測(cè)定：紫外分光光度法。 在強(qiáng)堿性介質(zhì)（ Ph） NaOH 存在下進(jìn)行蒸汽蒸餾，使全部植物堿包括煙堿、去甲基煙堿、假木賊堿和新煙堿等揮發(fā)而逸出，然后根據(jù)煙堿對(duì) 259nm 紫外光具有最大吸收 ，并且吸光度與煙堿含量正相關(guān)的性質(zhì)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)得待測(cè)液煙堿的吸光值，并進(jìn)一步計(jì)算出煙堿的含量。 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 10 頁(yè) 稱取測(cè)試樣品 左右，將樣品移置于 500ml 凱氏瓶中，加 NaCl25g，NaOH3g，再加蒸餾水 25ml 左右，使樣品全部在瓶底，然后將凱氏瓶連接于蒸汽蒸餾裝置，用蒸汽蒸餾，用裝有 10ml2NH2SO4溶液的 250ml 三角瓶，收集 220230ml餾出液，并檢查煙堿是否蒸凈（方法：用小試管接少量蒸出液加入 12%硅鎢酸和2NH2SO4 溶液各一滴，若混濁是沒(méi)有蒸徹底，清澈時(shí)即可停止蒸餾）蒸凈后移到250ml 容量瓶稀釋定容至刻度，用移液管吸取 10ml 到第二個(gè)容量瓶（ 100ml）中并用 ，將 10ml2NH2SO4溶液用蒸餾水稀釋至 250ml 做空白，并按照測(cè)試樣品溶液程序進(jìn)一步將空白稀釋至 100ml，用紫外分光光度計(jì)在 236nm、 259nm、 282nm 處測(cè)吸光值，若吸光值在 259nm 處超過(guò) ，則將所蒸餾得到的試樣溶液需擴(kuò)大稀釋倍數(shù)。 結(jié)果計(jì)算如下： )1( )]282236(2/1259[ ???? ?????? 含水率樣品重?zé)焿A VAAAF 注： ：與硅鎢 酸重量法相比的校正系數(shù)其中 A 為校正后的吸光值， A23 A25 A282 分別是在 2325 282nm 處觀察到的吸光值； ； F— 稀釋倍數(shù)； V蒸餾液的總體積 （ 5） 總糖的測(cè)定：砷鉬酸比色法（ Somogyi 法） 原理：在堿性條件下，還原糖可使銅離子（ Cu2+）還原成亞銅離子（ Cu+），氧化亞銅可與砷鉬酸試劑生成藍(lán)色溶液，生成的砷鉬藍(lán)溶液于 560nm 下光密度與還原糖濃度呈正比。此方法靈敏度高，測(cè)定范圍為 25～ 200微克，而且產(chǎn)物很穩(wěn)定。所以，不僅可以提高測(cè)定速度。還便于測(cè)定多份樣 品。因此， Somogyi 銅試劑比色法是目前糖定量測(cè)定中較好的方法之一。 （一）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確稱取 克葡萄糖溶于 1 升水中，取 100 毫升再定容至 1 升，即 150微克 /毫升。取 6支長(zhǎng)試管，分別加入 0、 、 、 、 及 毫升 150微克 /毫升的葡萄糖溶液，再加水補(bǔ)充到 毫升。然后準(zhǔn)確加入 毫升銅試劑，蓋上玻璃塞。 放入沸水浴中（試管必須浸入 1/2），自再沸騰起準(zhǔn)確記時(shí)，煮沸 20 分鐘， 然后立即取出，放在冷水中冷卻 5 分鐘。最后，加入 鉬酸試劑，再加 毫升蒸餾水稀釋，搖勻 后于 560nm 處比色。以光密度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。最好同時(shí)平行做三份。 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 11 頁(yè) （二）糖液的制備 稱取 克粉碎的樣品，放入錐形瓶中，加入 20毫升 80%酒精，在 70℃水浴中浸提 30分鐘，加入 2ml 醋酸鉛（沉淀蛋白質(zhì)），過(guò)濾前加 2ml 草酸鉀，將上清液濾入 100 毫升容量瓶。殘?jiān)俜謩e用 10毫升酒精浸提兩次各 20分鐘，過(guò)濾，用熱酒精沖洗濾渣，定容至刻度。吸取 5 毫升放入 50 毫升容量瓶，加水稀釋到刻度。（煙草樣品）此即為可溶性糖液。此糖液可用于煙葉還原糖、水溶性總糖的測(cè)定，而殘?jiān)捎糜诘矸鄣臏y(cè)定。 （三）水溶性總糖的測(cè)定 吸取清潔后的可溶性糖液 10ml 放入 25m1 容量瓶中，加入比重 HCl 2m1，煮沸 5 分鐘，使之轉(zhuǎn)化成還原糖后用 5mol/L NaOH 溶液中和，用酚酞為指示劑加至淡紅色為止。中和后用水稀釋至刻度。準(zhǔn)確稱取稀釋液 ，按標(biāo)準(zhǔn)還原糖測(cè)定步驟進(jìn)行，測(cè)得吸光值，從 標(biāo)準(zhǔn)曲線 上查出還原糖含量。 二、結(jié)果與分析 DH 系的農(nóng)藝性狀分析 黃葉突變體及其 DH 系與正常綠色材料的葉色存在顯著差異，其農(nóng)藝性狀也與綠色材料存在一定差異。本試驗(yàn)中選取烤煙黃葉突變體、黃葉 K32 K326 黃葉突變體的花藥培養(yǎng)所獲得的 2個(gè) DH 系（ H H8）和本地主栽品種 K326（ CK）作為供試材料。同時(shí)播種，相同的育苗條件和 田間管理。觀察發(fā)現(xiàn)突變體出苗的時(shí)間較對(duì)照略早，株高、葉長(zhǎng)、葉寬大于對(duì)照，長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)于主栽品種 K326。 如圖 1所示，在還苗期黃葉突變體和 H8株高均高于 K326，黃葉 K326 和 H1株高略低于 K326，但各材料與 K326 株高差異不顯著；在團(tuán)棵期黃葉突變體株高略高于 K326，黃葉 K32 H1 和 H8株高略低于 K326，但差異不顯著；在旺長(zhǎng)期黃葉突變體、黃葉 K32 H8 株高均 高于 K326 且差異顯著， H1株高低于 K326；在成熟期株高最高為 H1，其次是 H黃葉 K32黃葉突變體，各材料株高均高于 K326 且差異顯著。 在假植期、團(tuán)棵期和旺長(zhǎng)期，除 H1外各材料葉片數(shù)差異不大，在成熟期葉片數(shù)最多為 H8，其次是 H K32黃葉 K32黃葉突變體，并且各材料間差 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 12 頁(yè) 圖 1 不同生育期株高差異 異顯著（圖 2）。假植期時(shí) 黃葉突變體與黃葉 K326 相同，均為 片，較 K326多 片， H1 為 片，較 K326 少 片， H8為 片，較 K326 多 片。團(tuán)棵期時(shí)黃葉 K326 和 H8與 K326 相當(dāng)，分別為 1 和 片，突變體為10 片， H1 為 片，旺長(zhǎng)期黃葉突變體和黃葉 K326 均為 片， H1 為 片， H8 為 16 片，對(duì)照為 片， 其中 H1 在團(tuán)棵期和旺長(zhǎng)期葉片數(shù)比 K326 少34 片。 成熟期 H8 葉片數(shù)為 片， H1葉片數(shù)為 片， K326 葉片數(shù)為 片，黃葉 K326 葉片數(shù)為 片，最少為黃葉突變體 片， 可能是因?yàn)辄S葉突變體的側(cè)芽較多、且側(cè)芽生長(zhǎng)較旺盛，打頂去掉的葉片較多，導(dǎo)致了黃葉突變體的葉片數(shù)較少。 中部葉長(zhǎng)如圖 3所示，假植期五者中部葉 長(zhǎng)差異不大，團(tuán)棵期黃葉突變體中部葉長(zhǎng)最大，為 ，其次是 H黃葉 K32 K326，中部葉長(zhǎng)分別為 、 最短為 H1，中部葉長(zhǎng)為 。旺長(zhǎng)期黃葉突變體、黃葉K32 H8 中部葉長(zhǎng)均大于 K326， H1中部葉長(zhǎng)低于 K326，中部葉長(zhǎng)由長(zhǎng)到短為黃葉 K32黃葉突變體、 H K32 H1，中部葉長(zhǎng)分別為 、 、 、 。成熟期黃葉突變體、黃葉 K32 H H8 中部葉長(zhǎng)均大于 K326，最長(zhǎng)為 黃葉 K326，中部葉長(zhǎng)為 ，其次是 H黃葉突變體、 H1，中部葉長(zhǎng)貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 13 頁(yè) 分別為 、 、 ，對(duì)照 K326 中部葉長(zhǎng)最短，為 。 腰葉寬如圖 4 所示，各時(shí)期均為黃葉突變體最寬，成熟期時(shí)黃葉突變體與K326 的差距達(dá)到最大值 。黃葉突變體的其中一個(gè)親本 G28 的葉片較寬， 圖 2 不同生育期葉數(shù)差異 圖 3不同生育期中部葉長(zhǎng)差異 葉型為心型，這可能與黃葉突變體的葉片較寬有一定關(guān)系。在假植期 K326 比黃葉 K326 寬 ，其余時(shí)期黃葉 K326 均比 K326寬，成熟期是二者差距達(dá)到最貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 14 頁(yè) 大值 。在假植期、團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期 H1 中部葉均比 K326 窄，分別窄 、 ，成熟期 H1 比 K326 寬 。在假植期 H8 與 K326 腰葉寬差異不大，團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期、成熟期 H8 均較 K326 寬，在成熟期時(shí) H8與 K326 的差距達(dá)到最大值 。 圖 4不同生育期中部葉寬差異 圖 5 各時(shí)期葉厚動(dòng)態(tài)變化 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 15 頁(yè) 葉厚如圖 5所示，整個(gè)生育期均為 K326 的葉片最厚，黃葉突變體最薄，黃葉 K32 H1和 H8 介于二者之間。葉厚整體呈現(xiàn)先下降后增加的趨勢(shì) ，旺長(zhǎng)期達(dá)到最小值，可能是由于從假植期到旺長(zhǎng)期，根、莖生長(zhǎng)旺盛分配到的有機(jī)物較多，導(dǎo)致葉片逐漸變薄。旺長(zhǎng)期之后植株發(fā)育基本完全，葉片的增長(zhǎng)，增寬效率減小，但有機(jī)物還處于不斷積累的狀態(tài)，所以葉片再逐漸增厚。 綜合以上農(nóng)藝性狀分析，本黃葉突變體、黃葉 K32 H8 田間長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)于對(duì)照，H1在成熟期時(shí)長(zhǎng)勢(shì)也強(qiáng)于對(duì)照，可知黃葉突變性狀有促進(jìn)葉片長(zhǎng)、寬增加的作用。煙草是以收獲煙葉為目的的作物，葉片的增長(zhǎng)和增寬有利于提高煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量，有利于促進(jìn)農(nóng)民增產(chǎn)、增收，說(shuō)明該黃葉突變材料具備較高的生產(chǎn)利用價(jià)值。 不 同時(shí)期光合色素含量變化與分析 在生長(zhǎng)發(fā)育不同時(shí)期，對(duì)葉綠素 a（ Chla）、葉綠素 b（ Chlb），總?cè)~綠素（ Chla+Chlb）類胡蘿卜素（ Cx）含量的分析表明 (表 1)， K326 葉片中葉綠素 a、葉綠素 b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量均極顯著或顯著大于同一生育時(shí)期黃葉突變體、黃葉 K32 H1 和 H8。在團(tuán)棵期黃葉突變體與 K326 色素含量差異最大，黃葉突變體的 Chla、 Chlb 和 Cx 分別較對(duì)照低 %、 %和 %，但不同色素含量降幅差異不大，表明此黃葉突變材料為總?cè)~綠素缺乏型。葉片成熟時(shí)對(duì)照的 Chla 顯著大于黃葉突變體、黃葉 K