【文章內(nèi)容簡介】 示葉綠素 a和 b的濃度； Cx 表示類胡羅卜素的總濃度； D665 、D64 D470 表示葉綠體色素提取液在波長 665nm、 649nm 和 470nm 下的 OD 值。 步驟： 分別選取以上材料各 5株，每株采摘中部葉片各一片，去掉兩端和葉脈，剪成 2mm 左右的細(xì)絲混 勻，用電子天平精確稱量 放入 25mL 具塞刻度試管中（每個材料三次重復(fù)），加入 15mL95%的乙醇，置于 4℃的冰箱中浸提，期間貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計） 第 8 頁 搖晃 3至 4次，直至葉片全部變白，表明葉綠素已被浸提干凈，然后將浸提液定容到 25ml。以 95%乙醇為空白對照，用分光光度計分別測定波長在 665nm、 649nm和 470nm 下的 OD值。按公式分別計算葉綠素 a、 b和類胡蘿卜素的濃度（ ）及葉綠素總濃度。求得色素的總濃度后再按以下公式計算組織中各色素的含量（鄒琪， 20xx）。 樣品鮮重（或干重） 稀釋倍數(shù)）提取液體積（）色素濃度（葉綠素色素含量 ??? mlC 化學(xué)成分的測定 試驗材料 試驗材料與農(nóng)藝性狀測定相同， 供試材料為 K32黃葉突變體、 K326 黃葉突變體的花藥培養(yǎng)所獲得的 DH 系（ H H8）、黃葉 k326 ( K326 黃葉突變體 K326 BC4 F3)， 以 K326 作對照。、 試驗方法 于煙株團(tuán)棵期、旺長期、現(xiàn)蕾期、成熟期，選取中部 3 片葉，每個材料 10株。去除表面污漬、抽去主脈后，將葉片剪成碎塊放入烘干箱內(nèi)， 105℃殺青、60℃烘干、粉碎過 40目篩 ,裝入自封袋中以備化學(xué)成分分 析， 同樣選取烤后的中部 3 片煙葉，去除表面污漬、抽去主脈后，將葉片剪成碎塊放入烘干箱內(nèi)， 60℃烘干、粉碎過 40目篩 ,裝入自封袋中以備成分分析。 分析項目分別為全氮含量、全磷含量、全鉀含量、總糖含量、煙堿含量及蛋白質(zhì)含量。 （ 1）全氮采用過氧化氫 硫酸消化法 （一）消化 準(zhǔn)確稱取磨細(xì)混勻的煙樣 裝入 100ml 準(zhǔn)備好的凱氏燒瓶底部，標(biāo)號。樣品要加到燒瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶莖上。加少量水使之濕潤，再依次加濃硫酸 ，混合濕潤后慢慢地加熱至開始冒出大量白煙，微沸約 5分鐘繼續(xù)加熱微沸 25分鐘，取下稍放冷， 逐滴加入 30%過氧化氫 。作 1個空白對照，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質(zhì)，對樣品測定進(jìn)行校正。 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計） 第 9 頁 （二）蒸餾和吸收 蒸餾和吸收是在微量凱氏定氮儀內(nèi)進(jìn)行的。凱氏定氮蒸餾裝置種類甚多，大體上都由蒸氣發(fā)生、氨的蒸餾和氨的吸收三部分組成。 （三）滴定 樣品和空白蒸餾完畢后，一起進(jìn)行滴定。含氮量運用下列公式計算： 含水率）（ 取用倍數(shù)煙葉中的全氮 1W ???? NV 注：式中 NV 標(biāo)準(zhǔn)酸溶液的濃度 (mol/L)； W 試樣重量 (克 )； 每毫摩爾氮的克數(shù)。 （ 2） 全磷含 量的測定：礬鋁黃比色法。 吸取上述測 N 的消化待測原液 10ml 于 50ml 容量瓶中，加兩滴二硝基酚指示劑，用 NaOH 中和至剛呈黃色，加入 10ml 釩鉬酸銨試劑，用水定容搖勻。 15 分鐘后在分光光度計波長 440nm 處和 2cm 光徑的比色槽進(jìn)行比色測定，以空白溶液調(diào)節(jié)吸收值的零點。結(jié)果計算如下： 106*1* 100***ppmP% 含水率）（樣品重 分取倍數(shù)比色體積? （ 3） 全鉀含量的測定：火焰光度法。 吸取上述 N、 P的消化待測液 5ml 于 100ml 容量瓶中，用水定容 搖勻，直接在火焰光度計上測定，記錄檢流計的讀數(shù)，然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得待測液的鉀的濃度。 結(jié)果計算如下： 1061 100ppmK% ??? ???? 含水率）（樣品重 分取倍數(shù)測讀液體積 注：式中 ppm— 從工作曲線查得溶液中 K 的 ppm數(shù)；分取倍數(shù) — 待測液體積 /測讀液體積； 106— 將 ug換算成 g 的除數(shù)。 （ 4） 煙堿含量的測定：紫外分光光度法。 在強堿性介質(zhì)（ Ph） NaOH 存在下進(jìn)行蒸汽蒸餾，使全部植物堿包括煙堿、去甲基煙堿、假木賊堿和新煙堿等揮發(fā)而逸出，然后根據(jù)煙堿對 259nm 紫外光具有最大吸收 ，并且吸光度與煙堿含量正相關(guān)的性質(zhì)，用紫外分光光度計測得待測液煙堿的吸光值，并進(jìn)一步計算出煙堿的含量。 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計） 第 10 頁 稱取測試樣品 左右，將樣品移置于 500ml 凱氏瓶中，加 NaCl25g，NaOH3g，再加蒸餾水 25ml 左右，使樣品全部在瓶底，然后將凱氏瓶連接于蒸汽蒸餾裝置，用蒸汽蒸餾，用裝有 10ml2NH2SO4溶液的 250ml 三角瓶，收集 220230ml餾出液，并檢查煙堿是否蒸凈（方法：用小試管接少量蒸出液加入 12%硅鎢酸和2NH2SO4 溶液各一滴，若混濁是沒有蒸徹底，清澈時即可停止蒸餾）蒸凈后移到250ml 容量瓶稀釋定容至刻度，用移液管吸取 10ml 到第二個容量瓶（ 100ml）中并用 ，將 10ml2NH2SO4溶液用蒸餾水稀釋至 250ml 做空白，并按照測試樣品溶液程序進(jìn)一步將空白稀釋至 100ml，用紫外分光光度計在 236nm、 259nm、 282nm 處測吸光值，若吸光值在 259nm 處超過 ，則將所蒸餾得到的試樣溶液需擴大稀釋倍數(shù)。 結(jié)果計算如下： )1( )]282236(2/1259[ ???? ?????? 含水率樣品重?zé)焿A VAAAF 注： ：與硅鎢 酸重量法相比的校正系數(shù)其中 A 為校正后的吸光值， A23 A25 A282 分別是在 2325 282nm 處觀察到的吸光值； ； F— 稀釋倍數(shù)； V蒸餾液的總體積 （ 5） 總糖的測定：砷鉬酸比色法（ Somogyi 法） 原理：在堿性條件下，還原糖可使銅離子（ Cu2+）還原成亞銅離子（ Cu+），氧化亞銅可與砷鉬酸試劑生成藍(lán)色溶液，生成的砷鉬藍(lán)溶液于 560nm 下光密度與還原糖濃度呈正比。此方法靈敏度高，測定范圍為 25～ 200微克，而且產(chǎn)物很穩(wěn)定。所以，不僅可以提高測定速度。還便于測定多份樣 品。因此， Somogyi 銅試劑比色法是目前糖定量測定中較好的方法之一。 （一）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確稱取 克葡萄糖溶于 1 升水中，取 100 毫升再定容至 1 升，即 150微克 /毫升。取 6支長試管，分別加入 0、 、 、 、 及 毫升 150微克 /毫升的葡萄糖溶液，再加水補充到 毫升。然后準(zhǔn)確加入 毫升銅試劑，蓋上玻璃塞。 放入沸水浴中（試管必須浸入 1/2），自再沸騰起準(zhǔn)確記時，煮沸 20 分鐘， 然后立即取出，放在冷水中冷卻 5 分鐘。最后，加入 鉬酸試劑，再加 毫升蒸餾水稀釋，搖勻 后于 560nm 處比色。以光密度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。最好同時平行做三份。 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計） 第 11 頁 （二）糖液的制備 稱取 克粉碎的樣品，放入錐形瓶中，加入 20毫升 80%酒精，在 70℃水浴中浸提 30分鐘，加入 2ml 醋酸鉛（沉淀蛋白質(zhì)），過濾前加 2ml 草酸鉀，將上清液濾入 100 毫升容量瓶。殘渣再分別用 10毫升酒精浸提兩次各 20分鐘，過濾，用熱酒精沖洗濾渣，定容至刻度。吸取 5 毫升放入 50 毫升容量瓶，加水稀釋到刻度。（煙草樣品）此即為可溶性糖液。此糖液可用于煙葉還原糖、水溶性總糖的測定，而殘渣可用于淀粉的測定。 （三）水溶性總糖的測定 吸取清潔后的可溶性糖液 10ml 放入 25m1 容量瓶中，加入比重 HCl 2m1，煮沸 5 分鐘，使之轉(zhuǎn)化成還原糖后用 5mol/L NaOH 溶液中和，用酚酞為指示劑加至淡紅色為止。中和后用水稀釋至刻度。準(zhǔn)確稱取稀釋液 ，按標(biāo)準(zhǔn)還原糖測定步驟進(jìn)行，測得吸光值，從 標(biāo)準(zhǔn)曲線 上查出還原糖含量。 二、結(jié)果與分析 DH 系的農(nóng)藝性狀分析 黃葉突變體及其 DH 系與正常綠色材料的葉色存在顯著差異，其農(nóng)藝性狀也與綠色材料存在一定差異。本試驗中選取烤煙黃葉突變體、黃葉 K32 K326 黃葉突變體的花藥培養(yǎng)所獲得的 2個 DH 系（ H H8）和本地主栽品種 K326（ CK）作為供試材料。同時播種，相同的育苗條件和 田間管理。觀察發(fā)現(xiàn)突變體出苗的時間較對照略早，株高、葉長、葉寬大于對照，長勢強于主栽品種 K326。 如圖 1所示，在還苗期黃葉突變體和 H8株高均高于 K326，黃葉 K326 和 H1株高略低于 K326，但各材料與 K326 株高差異不顯著；在團(tuán)棵期黃葉突變體株高略高于 K326，黃葉 K32 H1 和 H8株高略低于 K326，但差異不顯著；在旺長期黃葉突變體、黃葉 K32 H8 株高均 高于 K326 且差異顯著， H1株高低于 K326；在成熟期株高最高為 H1，其次是 H黃葉 K32黃葉突變體，各材料株高均高于 K326 且差異顯著。 在假植期、團(tuán)棵期和旺長期，除 H1外各材料葉片數(shù)差異不大，在成熟期葉片數(shù)最多為 H8，其次是 H K32黃葉 K32黃葉突變體，并且各材料間差 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計） 第 12 頁 圖 1 不同生育期株高差異 異顯著（圖 2）。假植期時 黃葉突變體與黃葉 K326 相同，均為 片，較 K326多 片， H1 為 片，較 K326 少 片， H8為 片，較 K326 多 片。團(tuán)棵期時黃葉 K326 和 H8與 K326 相當(dāng)，分別為 1 和 片，突變體為10 片， H1 為 片，旺長期黃葉突變體和黃葉 K326 均為 片， H1 為 片， H8 為 16 片，對照為 片， 其中 H1 在團(tuán)棵期和旺長期葉片數(shù)比 K326 少34 片。 成熟期 H8 葉片數(shù)為 片， H1葉片數(shù)為 片， K326 葉片數(shù)為 片，黃葉 K326 葉片數(shù)為 片，最少為黃葉突變體 片， 可能是因為黃葉突變體的側(cè)芽較多、且側(cè)芽生長較旺盛，打頂去掉的葉片較多，導(dǎo)致了黃葉突變體的葉片數(shù)較少。 中部葉長如圖 3所示，假植期五者中部葉 長差異不大，團(tuán)棵期黃葉突變體中部葉長最大，為 ，其次是 H黃葉 K32 K326，中部葉長分別為 、 最短為 H1，中部葉長為 。旺長期黃葉突變體、黃葉K32 H8 中部葉長均大于 K326， H1中部葉長低于 K326，中部葉長由長到短為黃葉 K32黃葉突變體、 H K32 H1，中部葉長分別為 、 、 、 。成熟期黃葉突變體、黃葉 K32 H H8 中部葉長均大于 K326，最長為 黃葉 K326，中部葉長為 ，其次是 H黃葉突變體、 H1，中部葉長貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計） 第 13 頁 分別為 、 、 ，對照 K326 中部葉長最短，為 。 腰葉寬如圖 4 所示，各時期均為黃葉突變體最寬，成熟期時黃葉突變體與K326 的差距達(dá)到最大值 。黃葉突變體的其中一個親本 G28 的葉片較寬， 圖 2 不同生育期葉數(shù)差異 圖 3不同生育期中部葉長差異 葉型為心型，這可能與黃葉突變體的葉片較寬有一定關(guān)系。在假植期 K326 比黃葉 K326 寬 ，其余時期黃葉 K326 均比 K326寬，成熟期是二者差距達(dá)到最貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計） 第 14 頁 大值 。在假植期、團(tuán)棵期、旺長期 H1 中部葉均比 K326 窄，分別窄 、 ，成熟期 H1 比 K326 寬 。在假植期 H8 與 K326 腰葉寬差異不大，團(tuán)棵期、旺長期、成熟期 H8 均較 K326 寬，在成熟期時 H8與 K326 的差距達(dá)到最大值 。 圖 4不同生育期中部葉寬差異 圖 5 各時期葉厚動態(tài)變化 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計） 第 15 頁 葉厚如圖 5所示，整個生育期均為 K326 的葉片最厚，黃葉突變體最薄，黃葉 K32 H1和 H8 介于二者之間。葉厚整體呈現(xiàn)先下降后增加的趨勢 ，旺長期達(dá)到最小值，可能是由于從假植期到旺長期，根、莖生長旺盛分配到的有機物較多，導(dǎo)致葉片逐漸變薄。旺長期之后植株發(fā)育基本完全，葉片的增長，增寬效率減小，但有機物還處于不斷積累的狀態(tài)，所以葉片再逐漸增厚。 綜合以上農(nóng)藝性狀分析，本黃葉突變體、黃葉 K32 H8 田間長勢強于對照，H1在成熟期時長勢也強于對照，可知黃葉突變性狀有促進(jìn)葉片長、寬增加的作用。煙草是以收獲煙葉為目的的作物，葉片的增長和增寬有利于提高煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量，有利于促進(jìn)農(nóng)民增產(chǎn)、增收，說明該黃葉突變材料具備較高的生產(chǎn)利用價值。 不 同時期光合色素含量變化與分析 在生長發(fā)育不同時期，對葉綠素 a（ Chla）、葉綠素 b（ Chlb），總?cè)~綠素（ Chla+Chlb）類胡蘿卜素（ Cx）含量的分析表明 (表 1)， K326 葉片中葉綠素 a、葉綠素 b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量均極顯著或顯著大于同一生育時期黃葉突變體、黃葉 K32 H1 和 H8。在團(tuán)棵期黃葉突變體與 K326 色素含量差異最大，黃葉突變體的 Chla、 Chlb 和 Cx 分別較對照低 %、 %和 %，但不同色素含量降幅差異不大，表明此黃葉突變材料為總?cè)~綠素缺乏型。葉片成熟時對照的 Chla 顯著大于黃葉突變體、黃葉 K