【文章內(nèi)容簡介】 SO47H2O 洛陽市化學(xué)試劑廠 NaH2PO4 洛陽市化學(xué)試劑廠 Na2HPO4 天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心 KH2PO4 天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心 K2HPO4 天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心 甲基橙 天津市化學(xué)試劑一廠 鹽酸 洛陽市化學(xué)試劑廠 醋酸 開封化學(xué)試劑總廠 乙醇 洛陽吳華化學(xué)試劑有限公司 磷酸 開封開化有限公司 NaOH 天津市化學(xué)試劑廠 丙酮 洛陽市化學(xué)試劑廠 甲醛 洛陽市化學(xué)試劑廠 茚三酮 天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心 ε聚賴氨酸 SIGMA(固體標準品 ) 微生物發(fā)酵畢業(yè)論文 6 相關(guān)溶液 及其配制 [10] （ 1） mol/L 磷酸鈉緩沖溶液的配置 取 mL 的 mol/L 的 NaH2PO4 溶液和 mL 的 mol/L 的 Na2HPO4 混合即得到 mol/L 磷酸鈉緩沖溶液。 （ 2） 1 mmol/L 甲基橙溶液 稱取 g 甲基橙定容于 100 mL 磷酸鈉緩沖溶液中 。 （ 3） 1 mol/L 和 1 mol/LHCl：量取 90 mL 的 36%37%濃度的 HCl 定容于 1000 mL 蒸餾水中 。 mol/LHCl：量取 9 mL 的 36%37%濃度的 HCl 定容于 1000 mL 蒸餾水中 。 （ 4） 1 N 和 5 N 的 NaOH 溶液 1 N 的 NaOH 溶液：稱取 40 g NaOH 固體定容于 1000 mL 蒸餾水中 。 5 N 的 NaOH 溶液：稱取 10 g NaOH 固體定容于 50 mL 蒸餾水中 。 （ 5） N 的醋酸溶液 稱取質(zhì)量分數(shù)大于 % 的濃醋酸定容與 500 mL 蒸餾水中 。 （ 6） % 磷酸溶液 量取質(zhì)量分數(shù)為 85% 的磷酸定容于 1000 mL 蒸餾水中 。 實驗儀器 儀器名稱 生產(chǎn)廠商 723N 可見分光光度計 上海申安醫(yī)療器械廠 752 紫外光柵分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司 PYX— DHS— 40X50— BS— Ⅱ 電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠 GZX— GF— MBS— 1（ 9053A） 電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械廠 LD52A型低速離心機 北京醫(yī)用離心機廠 pHSJ4A型數(shù)字 PH計 上海雷磁儀器廠 LDZX— 50FB 立式 高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠 TGL— 16C 臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠 FA12048 電子天平 上海精密科技有限公司 THZ30℃恒溫培養(yǎng)搖床 上海 恒科學(xué)儀器有限公司 超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司 微生物發(fā)酵畢業(yè)論文 7 SW— CJ— 2F 型雙人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司 立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠 培養(yǎng)基 [11] （ 1） 高氏一號培養(yǎng)基 可溶性淀粉 2 g， K2HPO4 g， MgSO4 ?7H2O g， KNO3 g， NaCL g， FeSO4 ?7H2O g，瓊脂 g，水 1000mL， PH 值 （ 2） 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 牛肉膏 2 g， 蛋白胨 10 g， NaCl 5 g，瓊脂 15 g， 水 1000 mL （ 3） 貝特納培養(yǎng)基 葡萄糖 1 g/L， ， 蛋白胨 g/L， 酵母膏 g/L，瓊脂 g/L， pH 值 （ 4） 種子培養(yǎng)基 葡萄糖 5 g/L， 酵母膏 g/L， (NH4)2SO4 1 g/L， KH2PO4 g/L， K2HPO4 g/L， MgSO4 ?7H2O g/L， FeSO4 ?7H2O g/L， pH 值 （ 5） 發(fā)酵培養(yǎng)基 基本組成與種子培養(yǎng)基相同。在培養(yǎng)基碳氮源的優(yōu)化實驗中 ， 碳氮源含量按照正交實驗設(shè)計進行 ， 無機鹽的含量同種子培養(yǎng)基。在碳氮源最有條件下進行無機鹽優(yōu)化，在無機鹽的優(yōu)化實驗中，碳氮源按正交實驗設(shè)計最有條件配制。 2． 2 方法 菌種的分離與純化 [11] （ 1） 保藏菌種的活化與 稀釋涂布 取一環(huán)實驗室保藏菌株按 101用無菌水 進行 適當?shù)南♂?，吸取不?濃度的菌懸 mL 裝有 15 mL 左右的貝特納培養(yǎng)基的平板上， 30℃倒置培養(yǎng) 3～ 4 d。 再挑取菌落較大的進行劃線分離。 如圖 1： （ 2） 抑菌圈法 圖 1 聚賴氨酸 劃線平板 底層鋪 10 mL 下層培養(yǎng)基，將培養(yǎng)好的單菌落點接至培養(yǎng)基上， 30℃下培養(yǎng) 2 d，將上層培養(yǎng)基冷卻至 50℃左右，加入 10%敏感菌培養(yǎng)液搖勻，去 10 mL 鋪于底層培養(yǎng)基上。點解菌落間距要足夠大，以免抑菌圈互相重疊。將平板于 30℃恒溫培養(yǎng) 24 h， 出現(xiàn)邊緣清晰的 抑菌圈。 微生物發(fā)酵畢業(yè)論文 8 （ 3） 單菌落分離純化 挑選抑菌圈較大的菌落轉(zhuǎn)接到貝特納斜面培養(yǎng)基， 30℃恒溫培養(yǎng) 7 d，待斜面完全被孢子覆蓋，冰箱（ 4℃） 保存?zhèn)溆谩?如圖 2： 培養(yǎng)方法 （ 1） 種子培養(yǎng)液的制備 圖２ PL36 菌株 斜面 取 1 環(huán)斜面菌種于裝有 50 mL 種子培養(yǎng)基的 500 mL 三角瓶中，于 30℃、220r min1菌培養(yǎng) 24 h 得到種子培養(yǎng)液。 如圖 圖 4： 圖 ３ 種子培養(yǎng)液 圖 ４ 培養(yǎng)后的種子液 （ 2） 發(fā)酵培養(yǎng) 以 1%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接到裝有 50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的 250 mL 三角瓶中，在30℃， 220 rmin1條件下培養(yǎng) 72 h。 如圖 圖 6： 圖５ 發(fā)酵培養(yǎng)基 圖６ 發(fā)酵完成液 分析方法 （ 1） 發(fā)酵 液 pH 的測定 將發(fā)酵液 4000 r/min 離心 8 min， 上清液采用 pHSJ4 型 pH 計測定。 （ 2） εPL 產(chǎn)量的測定 發(fā)酵液中 εPL 產(chǎn)量的測定 ： 微生物發(fā)酵畢業(yè)論文 9 采用 Itzhaki 方法 [12] 測定 εPL 產(chǎn)量。測定前先將從水中重結(jié)晶的甲基橙 溶 于 pH值為 的 mol/L 磷酸鹽緩沖液 配制成濃度為 1 mmol/L的溶液 。將 mL 的磷酸鹽緩沖液和 mL、 1 mmol/L 甲基橙溶液依次加入到 mL 發(fā)酵液上清液中，所得混合物在 30℃條件下劇烈震蕩，反應(yīng) 30 min；然后 4000 r/min 離心 15 min，除去產(chǎn)生的 εPL 與甲基橙形成的復(fù)合物。取上清液 1 mL 用磷酸鈉緩沖液稀釋至 50 mL，在 465 nm 處測吸光度。 提取方法 采用 D152 弱酸性陽離子交換樹脂 (H 型 )對發(fā)酵法生產(chǎn)的 ε聚賴氨酸進行了分離提取 。 驗證方法 [13] 對發(fā)酵液進行紫外掃描，測定其最大吸收波長 ； 通過水 解洗脫濃縮液中的聚賴氨酸經(jīng)行紙層析，與標準賴氨酸的遷移率作對比。 微生物發(fā)酵畢業(yè)論文 10 3 結(jié)果與討論 εPL 標準曲線的繪制 聚賴氨酸的溴化物，甲基橙從水中重結(jié) 晶，并干燥至恒重，實驗前將兩者溶于pH 值為 的 。取 2 mL 不同濃度的聚賴氨酸溶液（ mg/L、 mg/L、 mg/L、 mg/L、 1 mg/L）與 2 mL、 1 mmol/L 的甲基橙混合，混合液震蕩反應(yīng) 30 min， 4000 r/min 條件下離心 15 min，取上清液稀釋至 50 mL，以磷酸緩沖液為空白樣，在 465 nm 下測其吸光度 A465。 表 1 不同濃度下 εPL 的吸光度 The absorbency of εPL in different concentration X Y 1 碳氮源優(yōu)化實驗 在 Streptomyces albulus PL36 產(chǎn)聚賴氨酸的單因素實驗結(jié)果上，選取葡萄糖量、(NH4)2SO4含量和酵母膏含量三個因素，利用正交表 L9(34)進行 3 因素 3 水平正交實驗。實驗設(shè)計、結(jié)果和分