【文章內(nèi)容簡介】 aaac ccaaaggcga agtgaaggta aaggttcggc ttgtccgggc 1021 tgaggtgaga tcctgctgtc ttgctcatac tttccaagtt gcgagcagtg ggcgcatcac 1081 cggcccgtcc catgacgtag acatgtgacc ttgcgttgcg tgcaccgtcg gggcggagca 1141 agagcgtaca cgttgaggcc cgaaagatgg tgaactatgc ttgcgaaggt tgaagccaga 1201 ggaaactctg gtggaggacc gtagcgattc tgacgtgcaa atcgatcgta taacgtgagt 1261 ataggggcga aagactaatc gaaccatcta gtagctggtt ccct 圖 4 28S LSU 序列測序結(jié)果 Fig 4 The sequenced results of 28S LSU 基于土耳其斯坦東畢吸蟲 28S LSU 序列構(gòu)建的進化樹 使用 Clustal X 軟件對土耳其斯坦東畢吸蟲及相關(guān)血吸蟲的 28S LSU序列進行 序列比對，提交引導(dǎo)樹； 利用 MEGA 軟件以鄰接法（ NeighborJoining，NJ 法）構(gòu)建 土耳其斯坦東畢吸蟲進化樹 ，通過 自引導(dǎo)獲得系統(tǒng)樹分支的置信度（重復(fù)次數(shù)為 3 000 次），構(gòu)建時以肝片形吸蟲（ Fasciola hepatica）的 28S LSU序列 作為外群，以獲取系統(tǒng)樹的根 （圖 5） 。 8 3 討論 我們選用 28S LSU 序列作為分子標記研究土耳其斯坦東畢吸蟲的系統(tǒng)發(fā)生情況。 核糖體 DNA 是生物體內(nèi)最保守的基因之一，是細胞核內(nèi)編碼核糖體RNA 的基因，為一類中度重復(fù)序列，以串聯(lián)多拷貝的形式存在于細胞核內(nèi)染色體 DNA 中，每個重復(fù)單位由非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和 3 種核糖體基因編碼 區(qū)（ 18S rDNA、 rDNA、 28S rDNA）組成，其中 18S rDNA、 rDNA 和 28S rDNA 基因組成一個轉(zhuǎn)錄元，產(chǎn)生一個前體 RNA。 28S rDNA 具有重要的生物學(xué)功能而且在進化過程中比較保守，作為分子標記被廣泛應(yīng)用于多種寄生蟲遺傳變異、分類、進化等方面的研究 。 寄生哺乳動物的血吸蟲，主要分三個種團。曼氏血吸蟲種團包括流行于非洲、南美洲及加勒比地區(qū)的 4 個蟲種：曼氏血吸蟲（ S. mansoni） 、羅氏血吸蟲（ S. rodhaini）、愛德華血吸蟲（ S. edwardiense）、河馬血吸蟲（ S. hippopotami），蟲卵以側(cè)刺形為主，中間宿主為雙臍螺（ Biomphalaria spp.）；埃及血吸蟲種團包括流行于非洲及鄰近地區(qū)的 7 種血吸蟲：埃及血吸蟲（ S. haematobium）、間插血吸蟲（ S. intercalatum）、麥氏血吸蟲（ S. mattheei）、牛血吸蟲（ S. bovis）、柯拉松血吸蟲（ S. curassoni）、馬格里血吸蟲（ S. margrebowiei）、萊氏血吸蟲（ S. leiperi），蟲卵以端刺形為主，中間宿主為小泡螺（ Bulinus spp.）；日本血吸蟲種團包括流行于我國和東南亞的 4 種血吸蟲：日本血吸蟲（ S. S. bo v isS. i nterc al at umS. c uras soniS. haem at obiu mS. le i periS. m argre bowi eiS. r odhai niS. m ans on iO. tu rkest anic umS. e dwa r die nseS. hipp opot amiS. j aponic umS. m ala ye nsi sS. mek ongiF. hepatic a100100100100726448989094770 .02Af ri c anschis t osome sAsianschis t osome sv isnterc al at umuras soniat obiu mi periargre bowi eiodhai nians on i rkest anic umr die nsehipp opot amiaponic umala ye nsi songihepatic a圖 5 基于土耳其斯坦東畢吸蟲 28S LSU 序列 構(gòu)建的進化樹 Fig. 5 Phylogeic relationships of O. turkestanicum with other members of the Schistosomatidae reconstructed by neighborjoining method based on the 28S LSU gene using Fasciola hepatica as the outgroup. Number at the branch nodes indicates percentage bootstrap support for 3000 replicates. 9 japonicum）、湄公血吸蟲（ S. mekongi）、中華血吸蟲（ S. sinensis）、馬來血吸蟲（ S. malayensis），以圓刺或微刺形蟲卵為主，中間宿主為釘螺（ On elania） 或擬釘螺（ Tricula aperta），小羅伯特螺（ Robertsiella）。除以上三個主要種團外，尚有人提及印地血吸蟲種團（ Schistosoma indicum group），包括印地血吸蟲（ S. indium ）、 棱形血吸蟲（ S. spindale）、鼻血吸蟲（ S. nasale）、未明血吸蟲（ S. ineognitum），蟲卵為端刺形，中間宿主為印度扁卷螺（ Indoplanorbis），流行于印度次大陸及東南亞 [10 11]。 土耳其斯坦東畢吸蟲也是一種 寄生于哺乳動物的血吸蟲。 在 1929 年以前土耳其斯坦東畢吸蟲是歸屬于裂體屬的稱為土耳其斯坦裂體吸蟲，但是在 1929 年由于其雄蟲睪丸數(shù)等形態(tài)差異被歸為鳥畢屬，后又被劃分為東畢屬作為其代表蟲種 [ 9, 12]。 通過對血吸蟲 28S 序列構(gòu)建的進化樹研究發(fā)現(xiàn)，土耳其斯坦東畢吸蟲的發(fā) 生位置處于裂體屬血吸蟲中，同時處于非洲血吸蟲種群中。 這 與土耳其斯坦東畢吸蟲傳統(tǒng)的分類地位 不同。 研究結(jié)果與土耳其斯坦東畢吸蟲線粒體基因 cox1 和 nad1 構(gòu)建的進化樹結(jié)果一致 [13]。 4 結(jié)論 對中國大陸牛源土耳其斯坦東畢吸蟲的 28S LSU 序列 進行了 PCR 擴增，構(gòu)建了土耳其斯坦東畢吸蟲的分子進化樹 ， 推斷 土耳其斯坦東畢吸蟲歸屬于裂體屬。 10 參考文獻 [1] 劉鐵男 , 趙秋紅 , 于克江 , 等 . 牛羊東畢吸蟲病的防治 [J]. 中國獸醫(yī)雜志 , 2021, 10: 2930. [2] 王春仁 , 仇建華 , 于萬才 , 等 . 土耳其斯坦東畢吸蟲在絨山羊中發(fā)現(xiàn) [J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī) , 1992, 2: 21. [3] 王春仁 , 皮寶安 , 宋卓 , 等 . 黑龍江省牛羊東畢吸蟲病流行情況與地理分布特征的調(diào)查研究 [J]. 動物醫(yī)學(xué)進展 , 2021, 121: 9192. [4] 邢繼蘭 , 王春仁 , 何國聲 .土耳其斯坦東畢吸蟲 cDNA 文庫的構(gòu)建 [J]. 中國人畜共患病雜志 , 2021, 20(7): 637639. [5] 魏佳 , 何國聲 , 姚寶安 , 東畢吸蟲病的研究進展等 [J]. 河北科技師范學(xué)院學(xué)報學(xué) , 2021, 19(1): 7077. [6] 白功懋 , 劉忠 , 劉兆銘 . 吉林省稻田皮炎病因的調(diào)查研究 I. 土耳其斯坦東畢吸蟲及其與稻田皮炎的關(guān)系 [C]. 一九六三年寄生蟲專業(yè)學(xué)術(shù)討論會論文摘要集匯編 , 1963. 167168. [7] 李志華 , 李春禮 . 黑龍江省稻田皮炎病因?qū)W的研究 [C]. 全國家畜寄生蟲病科研工作第二次會議論文摘要文集 , 1980, 129130. [8] Skrjabin KI. Schistosoma turkestanicum nov. sp. ein neuer parasit des Rindes aus Russisch, Turkestan[J]. Ztschr Infektionskr u Haus tier, 1913, 13: 457468. [9] Dutt SC, Srivastava HD. A revision of the genus Ornithobilharzia Odhner, 1912 (Trematoda: Schistosomatidae)[M]. Proc. 42nd Sci. Conger, 1955, 3: 285. [10] Rollinson D, Simpson AJG. The biology of Schistosomes: from genes to latrines[M] London U. K. A cademic Press, 1987: 149. [11] 趙慰先 , 高淑芬主編 . 實用血吸蟲病學(xué) [M]. 第 1 版 . 北京 : 人民衛(wèi)生出版社 , 1996: 320. [12] Price EW. A synopsis of the trematode family schistosomatidae with descriptions of new genera and species[J]. Proc. U. S. Nat. mus. Wash. 1929, 75(3): 139. [13] Li L, Yu LY, Zhu XQ, et al. Orientobilharzia turkestanicum is grouped within African schistosomes based on phylogeic analyses using sequences of mitochondrial genes[J]. Parasitol Res, 2021, 102(5): 939943. 11 致 謝 本課題是在 黑龍江 *********************************************** ************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************ 12 附錄 1 主要試劑及其配制 DNA 裂解液 ： mol/L NaCl 70 μL； mol/L TrisHCl （ ） 30 μL； mol/L EDTA （ ） 150 L； 10% SDS 30 μL；蛋白酶 K （ 20 mg/μL） 20 μL。其中 NaCl、 TrisHCl、 EDTA 經(jīng)過高壓滅菌。所配溶液均使用去離子水。 電泳緩沖液 50Tris乙酸 （ TAE） ：成份及終濃度（配制 1 L 溶液各成份的用量）為 2 mol/L Tris堿： 242 g； 1 mol/L 冰醋酸： mL； 100 mmol/L EDTA： 100 mL mol/L （ pH ） 。 氨芐青霉素 （ Amp） ：貯存液，將 1 g 氨芐青霉素溶解于 10 mL 蒸餾水中，終濃度為 100 mg/mL，用 μm 濾膜過濾除菌，分裝， 20℃ 儲存?zhèn)溆谩? IPTG：溶解 250 mg 的 IPGT（異丙基硫代 βD半乳糖苷）于 10 mL水中，分成小份貯存于 20℃ 。 Xgal： X－ gal（ 5溴 4氯 3吲哚－ β半乳糖苷）：溶解 25 mg 的 X－gal 于 1mL 的二甲基甲酰 胺 （ DMF） ,用鋁箔包裹裝液管，貯存于 20℃ 。 LB 平板 ：稱取 1%（ W/V） 蛋白胨 2 g、 %（ W/V） 酵母提取物 1 g、1%（ W/V） NaCl 2 g、 %（ W/V） 瓊脂粉 3 g 加去離子水將培養(yǎng)基定溶至200 mL，漩渦震蕩器溶解后，滴加 5 mol/L NaOH（約 mL），調(diào)節(jié) pH 值至，高溫高壓滅菌， 4℃ 保存。 含氨芐青霉素 /IPTG/Xgal 的 LB 平板 ：按正常程序制備氨芐青霉素平板時，補加 IPTG 和 Xgal 至終濃度的 mM IPTG 和 80 mg/mL Xgal,而后倒出培養(yǎng)基、鋪制平板，另一種方法是在使用前將 100 μL 的 100 mM IPTG 和 20 uL 的 50 mg/mL Xgal 涂到氨芐青霉素平板的表面上，并在 37℃ 孵育 30 min使之吸收后使用。 SOC 培養(yǎng)基 （ 100mL） ：將胰蛋白胨 （ 1M， g） 、酵母抽提物 （ 1M， g） 、 NaCl（ g） 及 KCl（ 1 mol/L， g） 加到 97 mL 的去離子水中，攪拌使之溶解。高壓滅菌并冷卻到室溫。加入 2M Mg2+母液 （ g）和 2M 葡萄糖 （ g） 至終濃度 20 mM，補加消毒毒蒸餾水至 100 mL，完全培養(yǎng)基用 μm的濾膜過濾滅菌，最終濃度 pH 值為 。 含氨芐青霉素的 LB 液體培養(yǎng)基 ：先制備 LB 液體培養(yǎng)基 ,取胰蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g， NaCl 10 g，加入 1 000 mL 蒸餾水中，用 5 M NaOH 調(diào)pH 為 ，高壓滅菌 20 min，待溫度降至 50℃ 加入氨芐青霉素，配成終濃度為 100 μL/mL。 質(zhì)粒提取溶液 ： （ 1） SolutionⅠ ： 50 mmol/L Glucose,25mmol/L TrisHCl（