【正文】 for ionic liquids with cation [C4mim]+[34] 相比，其粘度有很大的差別，這是由于 Tf2N具有很大的對稱性，因而造成其粘度很低 [35]。離子液體中的 pH 過高或過低都將導(dǎo)致酶變性失活 。 ４）離子液體的純度。 在溶有過氧化物酶的有機(jī)或離子液體中通過添加 H2O2催化磺化 反應(yīng) 的發(fā)生 ，已悄悄成為一種新的方法。 生物亞砜化方法可分為 : (1)酶 ， 如細(xì)胞色素 P2450 酶、環(huán)己烷單加氧酶、氯過氧化酶、溴過氧化酶 ； (2) 微生物 ， 如細(xì)菌 ( Corynebacterium equi ATCC2110Pseudomonas putida UV4)、真菌 ( Helminthosporium 、 Mortierella isabellina)； (3) 抗體，該方法具有工藝綠色、底物 P酶比率高且對某些底物可以取得高光學(xué)純度 ， 例如芳基甲 P乙基硫醚、二硫代縮醛等底物取 得了高達(dá) 99 %.。 近年來 ， 多種生物催化劑已被應(yīng)用于潛手性硫醚的不對稱氧化 ， 包括氯過氧化物酶、錳過氧化物酶、深黃被孢霉、馬棒桿菌等 。 表 2 不同 pH 值的磷酸鹽緩沖液 Table 2 Different PH values in phosphate buffer 試劑 pH M Na2HPO4 M NaH2PO4 、過氧化氫含量及 pH 值 等反應(yīng)條件的優(yōu)化 取 4 支 2ml具塞離心管分別加入 500μl氧化反應(yīng)體系 （ pH分別為 、 、 、）， 含： 苯甲基硫醚溶液（溶解于 異丙醇 ） ， 辣根過氧化物酶溶液 （ 、 12 1 mg/ml、 mg/ml、 2 mg/ml） ，過氧化氫（ 2mM、 4mM、 6mM、 8mM） ，在 20℃ 、28℃ 、 36℃ 、 44℃ 恒溫 水浴鍋中 反應(yīng)。反應(yīng) 20 分鐘后往各個 樣 （ 200μL）中分別 添加 20μL的 Na2SO3（ 1mol/L, 溶解于 pH= 的 ）讓酶失活，再用 乙醚萃取，然后取 20μl 上清液作 HPLC 分析 。然而 pH 值對反應(yīng)產(chǎn)量的正面影響是先升后降。 在 1mM～ 6mM 氧化劑之間， . 值隨氧化劑含量的增加而逐漸增大， 在 6mM～ 20mM 氧化劑之間 ，而底物轉(zhuǎn)化率隨氧化劑增加緩慢增大。 底物濃度對反應(yīng)的 影響也很大，對轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生一定的影響，底物濃度增大，轉(zhuǎn)化率會有一定的提高，但也不是很明顯，實驗中底物從 1mM 提高到 40mM 時，轉(zhuǎn)化率提高了 5 個百分點(diǎn)左右。希望可以有更廉價的酶對反應(yīng) 可以起作用，這有利于開展 更多量的實驗研究。 結(jié)果與討。只有在少數(shù)情況下，對強(qiáng)極性底物如多羥基化合物才考慮采用中等極性或與水互溶性溶劑如四氫呋喃等，在這些溶劑中，除 極少數(shù)特別穩(wěn)定的酶如枯草桿菌蛋白酶外，絕大多數(shù)酶都會失活。 綜合考慮 值和產(chǎn)量，本實驗底物濃度選在10mM。 轉(zhuǎn)化率在后期有所提高，但變化也不大，因為在 1mM 時產(chǎn)率為 91%，但底物濃度提高到 40mM 時，產(chǎn)量轉(zhuǎn)化率為 95% 。 過氧化氫的添加方式對 酶促 不對稱氧化反應(yīng)的影響 過氧化氫等量 不同次數(shù)添加對酶促不對稱氧化反應(yīng)的影響 底物轉(zhuǎn)化率（ % ）e . e 值（ % ）0102030405060701 2 3 4 5氧化劑添加次數(shù)e.e.值(%)74757677787980底物轉(zhuǎn)化率(%) 圖 等量過氧化氫分不同次數(shù)添加對不對稱氧化的影響 Fig. Effect of H2O2 adding style at stable concentration on sulfoxidation 在 6mM 濃度下進(jìn)行， 隨氧化劑添加次數(shù)的增多而增大，而轉(zhuǎn)化率反之 。 、 13 苯甲硫醚標(biāo)準(zhǔn)曲線051015200 1 濃度（m M ）峰面積（AU*S） 圖 為不對稱氧化反應(yīng)底物苯甲硫醚的標(biāo)準(zhǔn)曲線 其回歸方程為 y = + 底物轉(zhuǎn)化率（ %）＝（反應(yīng)前底物濃度 反應(yīng)后底物濃度） /反應(yīng)前底物濃度 100% ％＝ [(SR )/(S+ R )] 100％ 用高效液相色譜檢測反應(yīng)體系中苯甲硫醚、 R苯甲亞砜、 S苯甲亞砜的濃度，分析條件如下： 儀器：高效液相色譜（ HPLC） LC2100， FID 檢測器， 美國 Agilient 公司； 流動相：異丙醇 /正已烷 (15/85,v/v)；流速： ml/min；柱溫： 30℃；進(jìn)樣量： 20μL ；手性色譜柱： Chiralcel ODH（ 15cm）；檢測波長為 242 nm。 過氧化氫等量不同次數(shù)添加對酶促不對稱氧化反應(yīng)的影響 通過多因素多水平分析，選取一個底物相 對酶過量的反應(yīng)體系來探索酶與氧化劑的最適比例。 酶催化各種硫化物氧化獲得手性亞砜及其絕對構(gòu)型的新技術(shù)突破了天然酶源的局限性 ， 為發(fā)展更多性能更加優(yōu)良的酶或新功能酶提供了條件； 10 預(yù)計在今后的十來年內(nèi) ， 將會有更多優(yōu)于傳統(tǒng)化學(xué)路線的 生物催化方法被廣泛應(yīng)用于各種精細(xì)化學(xué)品的工業(yè)生產(chǎn)中 。 目前許多生物活性分子中都含有一個亞磺酰的立體中心結(jié)構(gòu) ， 而且立體化學(xué)不同的對映體可能具有不同的生理活性及代謝作用 。 Sergei 等 [38]報道了許多具有催化非天然、非生 9 理，立體選擇性的轉(zhuǎn)化過程能力的酶和 非酶蛋白在有機(jī)化學(xué)中都很有用：例如，辣根過氧化酶能催化酚類物質(zhì)，又能催化各類與其非相關(guān)的反應(yīng)，包括不對稱的磺化氧化反應(yīng)和過氧化物還原反應(yīng)；普遍存在的牛血清白蛋白雖然不具有催化功能，但是也能催化不對稱磺化氧化反應(yīng)。獲得高純度的離子液體是離子液體用于生物催化的首要條件。當(dāng)然，離子液體中水活度過低，酶將難以維持其活性構(gòu)象、發(fā)揮催化作用。因為 其性質(zhì) 是可調(diào)的，所以其也被稱為“設(shè)計者”的溶劑。 陽離子的結(jié)構(gòu)對離子液體粘度的影響也是比較大的 ，這主要是由氫鍵和范得華力來決定的 [3136]。 但對于不對稱氧化的研究一直集中在有機(jī)化學(xué)方學(xué)方面，而在離子液 體中進(jìn)行不對稱氧化反應(yīng)的相關(guān)研究和反應(yīng)規(guī)律卻不多。亞磺?；鶃啺芬呀?jīng)被發(fā)展成易制和高效的手性配體 ， 例如雙亞磺?；鶃啺?BISOX 2（圖 ） 在雜 DielsAlder 反應(yīng)取得 98 %ee 。通過選用不同的反應(yīng)條件 ， 可分別合成 出兩種構(gòu)型的對映體 [25]。 手性亞 砜 的性質(zhì) 1）手性亞 砜 具有光學(xué)活性。因此，欲將離子液體應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，除了降低離子液體的生產(chǎn)成本，還必須很好 地解決離子液體的回收及循環(huán)使用這一重要問題。手性離子除具有一般手性物體的功能特征外，還具有一般液體材料沒有的優(yōu)異特性，如： [15] 1) 較低的揮發(fā)性和在常溫下幾乎觀察不到的蒸汽壓； 2) 非易燃性； 3) 對許多有機(jī)和無機(jī)手有良好的溶解性； 4) 是一類極性的、非配位的溶劑； 5) 有非常寬的液態(tài)范圍； 6) 可通過選擇陰、陽離子對其理化性質(zhì)進(jìn)行調(diào)控。 常規(guī)離子 液體的陽離子一般為含有 N或 P的有機(jī)大離子，其中季銨類離子包括 [16]： 1）咪唑離子 [im]+及其取代衍生物。 目前離子液體不再只是實驗室用樣品，默克（ Merk）等許多公司已經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)離子液體作為商品出售， Merk 公司的產(chǎn)品多達(dá) 150 種。在 1992 年，當(dāng) Wilkings 和 Zaworotko 合成四氟硼酸鹽離子液體時，才意 味著第二代離子液體的產(chǎn)生，同時也是離子液體方法的誕生[10]。隨著人們對離子液體的深入研究，人們認(rèn)為把熔點(diǎn)定義在室溫附近太狹窄，有些離子化合物的熔點(diǎn)高于室溫但低于水的沸點(diǎn)。而在這一領(lǐng)域中，硫醚的不對稱氧化反應(yīng)一直愛到廣泛的關(guān)注。手性對映體在性質(zhì)上往往表示出差異，有時甚至表現(xiàn)出百花截然不同的性質(zhì) [12]。 近年來，離子液體被廣泛關(guān)注，其在各方面的應(yīng)用的報道日益增多 ， 尤其是在 作為 生物催化 反應(yīng)的溶劑和共溶劑更是備受關(guān)注。 這種物質(zhì)的廣泛應(yīng)用可以很好的解決 環(huán)境污染問題。構(gòu)成生物體系的大多數(shù)生物大分子的重要構(gòu)件僅以單一的對映形態(tài)存在。 在眾多的不對稱合成中反應(yīng)中，人類獲取具有生物活性光學(xué)純化合物的最有了展前途的是不對稱催化法 [5]。正是因為如此，對離子液體的稱謂比較多，如室溫離子液體、室溫溶鹽、離子液體、室溫有機(jī)鹽等。 20世紀(jì) 80年代早期，英國 BP公司和法國的 IFP 等研究機(jī)構(gòu)開始較系統(tǒng)地探索離子液體作為溶劑和催化劑的可能性。北大本洋化約組織（ NATO）于 20xx 年召開了有關(guān)離子液體的會議 [11]；歐盟制定了離子液體的研究計劃 [12]；日本有關(guān)離子液體的研究也很活躍 [13]。 常規(guī)離子液體 AlCl3 是最早研究的常規(guī)離子液體，但由于其不穩(wěn)定一直不是研究的重點(diǎn)，所以在此一般不包括其。下 表 （ 1）為一些常見的 研究得較多的的 常規(guī) 陽、陰 離子液體組成： 表（ 1） [16] 4 手性離子液體 大家都知道 手性的 研究在生命科學(xué)、制藥以及材料科學(xué)中起著極為生要的作用。 [22] 離子液體的重復(fù)利用問題 離子液體的價格比有機(jī)溶劑昂貴得多。 手性亞 砜 和不對稱氧化反應(yīng) 手性亞 砜 手性亞 砜 的概念 手性亞 砜 是可以作為手性輔助劑和中間體用于合成復(fù)雜的手性天然化合物；作為手性配體或手性催化劑用于多種不對稱催化反應(yīng)；作為手性藥物用于治療胃潰瘍的質(zhì)子泵（如 esomeprazole） 等 [23]。 3） 兩種構(gòu)型的對映體都能夠得到。例如 ，對甲苯基甲基亞砜首次被作為催化劑 (或者稱促進(jìn)劑 ) 促進(jìn)烯丙基三氯硅烷與亞胺的加成反應(yīng) ， 盡管需要 3 倍于亞胺的量的手性亞砜來催化。因此 ,Sharpless 在不對稱氧化領(lǐng)域中的卓越貢獻(xiàn)分享了 20xx 年諾貝爾化學(xué)獎 [30]。在離子液體中加入能與之相溶的有機(jī)溶劑或水 ， 可降低離子液體的粘度。 所以可以通 過添加不同的陰陽離子組分和比例調(diào)離子液體的粘度到合適的范圍，再在反應(yīng)物中作反應(yīng)中介。離子液體中的水活度過大，會降低酶的熱穩(wěn)定性，對諸如酯化、轉(zhuǎn)酯、氨解或胺解反應(yīng)，過高的水活度會加速副反應(yīng)，降低產(chǎn)率及產(chǎn)物的對映體純度。 同樣在生物催化氧化中，研究表明， 離子液體中鹵素離子含量低于 ％（ w/v）時，對酶活性沒有影響，鹵素離子含量過高會導(dǎo)致酶活顯著下降。 Yuchun Xie 等 [37]研究了 HRP 與保護(hù)劑或配基共凍干后在分支醇溶劑中催化的立體選擇性得到了極大的提高。但也存在酶或微生物的價格昂貴、底物濃度低和底物適用范圍窄 (取代基的細(xì)微改變就導(dǎo)致對映選擇性的劇烈下降 ) 等問題。 酶催化反應(yīng)在過去的十幾年間得到了飛速的發(fā)展 ， 并成為現(xiàn)代有機(jī)合成方法的一種強(qiáng)有力的補(bǔ)充手段 。 于 1h、 3h、 5h、 7h分別取樣 200μL，添加 20μL的 Na2SO3（ 1mol/L, 溶解于 pH= 的 ）讓酶失活，再用乙醚萃取，然后取 20μl 上清 作 HPLC 分析。 在 4 個 2ml具塞離心管中分別加入 1ml反應(yīng)液 {}，包括適量苯甲硫醚 {1mM、10mM、 20mM、 40mM }、 1mg/ml 辣根過氧化物酶、 3mM H2O2 和 10%異丙醇｛ V/V｝，混合均勻后，置于水浴恒溫振蕩器內(nèi)反應(yīng)（ 28℃、 180 r/min），反應(yīng) 20 分鐘后分 別取樣 200μL，添加 20μL的 Na2SO3（ 1mol/L, 溶解于 pH= 的 液）讓酶失活，再用 乙醚萃取，最后取 20μl 上清作 HPLC 分析。綜上所述，此氧化反應(yīng)的最適 pH 值為。 底物濃度對酶促芳香基硫醚不對稱氧化反應(yīng)的影響 606 0 . 16 0 . 26 0 . 36 0 . 46 0 . 56 0 . 66 0 . 76 0 . 86 0 . 9611mM 10mM 20mM 40mMS u b s t r a t e c o n t e n t ( m M )e.e.s(%)888990919293949596Conversion(%) 17 圖 底物濃度對酶促硫醚不對稱氧化反應(yīng)的影響 Fig Effect of substrate concentration on sulfoxidation 從圖中可以看出，底物濃度從 1mM 到 40mM 的過程， 底物濃度對 有 影響 ，但并不是表現(xiàn)得很明顯 ， 這可能與 HRP 酶本身的特性有關(guān)。但底物濃度對產(chǎn)物的 ，從 1mM 提高到 40mM 的過程中幾乎沒有變化。 18 第三 章 有機(jī)溶劑中 HRP 促甲基苯 基硫醚不對稱氧化反應(yīng)的研究 實驗材料 （ 同 ） （ 同前 ） 、 （ 同前 ） （ 同前 ） 實驗方法 一般來說， logp 值介于 0～ 3 的溶劑不宜作為酶催化反應(yīng)的非水