【正文】 與對映體過量值綜合考慮， 控制 H2O2 為 6 mM 為 宜 。 所以 為了得到更高的選擇性等綜合因素的考慮，在反應(yīng)中應(yīng)該采取分批次地加入過氧化氫的方法。 pH 對反應(yīng)的影響特別明顯， pH 的過高或過低對反應(yīng)都非常的不利，應(yīng)該通過重復(fù)多次實驗和正交實驗來確定最佳的反應(yīng)體系 pH 值，本實驗最佳的 pH 是 。 本實驗中過氧化氫的添加量為 6mM，分開五次加到反應(yīng)體系中。 pH 值的影響 取 6 個 10ml 離心管 ,加入 4ml 反應(yīng)液 {}，包括 2mM 苯甲硫醚、 1mg/ml 辣根過氧化物酶、 3mM H2O2 和適量有機溶劑｛ 1%、 5%、 10%、 20%、 40%、 80%， V/V｝，混合均 勻后， 用 pH 計分別測 pH 值。 故選甲醇（ logp=）、乙醇（ logp=）、異丙醇（ logp=）作為本反應(yīng)的有機溶劑。 過氧化氫對反應(yīng)的影響是很明顯也是很直接的，一次性地加 入過氧化氫，過量的過氧化氫會使酶總份地失活，從而導(dǎo)致反應(yīng)率的下 降，分批多次的加入過氧化氫的方法可以很好的解決這個問題。 考慮到 值和產(chǎn)量因素，底物濃度選在 10mM 為宜。如果分批不同次數(shù)的加入過氧化氫，過氧化氫不會使酶失活，可以很 16 好地使 酶 變成另外的一種構(gòu)型催 化磺化反應(yīng)的進行，所以此時的 更 好的體現(xiàn) ，而且是隨著加入的次數(shù)的增多， ， 但 產(chǎn) 物的轉(zhuǎn)化率卻下降了，這是由于分批加入的過氧化氫 使酶的利用率提高，而氧化劑自發(fā)的氧化作用減弱。色譜圖見附錄 。 反應(yīng) 在 28℃ 恒溫 水浴鍋中進行，從第一次添加 H2O2 溶液開始計時，分批添加若干次，每次時間間隔 1 分鐘 ,則 5 支管分別添加 5 次 。 本文擬研究不同的離子液體中反應(yīng)條件等等對甲基苯基硫醚不對稱氧化成亞砜的影響。 本課題的立項意義及研究內(nèi)容 手性亞砜作為一種重要的手性中間體藥物，在醫(yī)藥和醫(yī)療上有著重大的作用。 JuHyun Yu 等 [40]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng) HRP 與 D脯氨酸共凍干后，其在非水相介質(zhì)中催化氧化反應(yīng)的對映選擇性得到了極大提高 。 二 ）水溶性的離子液體，先用碳酸鈉溶液洗滌，然后硅膠過濾，真空干燥。實際上，用碳酸鈉溶液沖洗、純化離子液體將對離子液體的 pH 值和水活度有一定的影響。 離子液體的表面張力一般比有機溶劑高，但比水的表面張力低，這樣使用離子液體就可以加速分離的過程。如 [bmim]+中側(cè)鏈短小， 圖 不同溫度下離子液體（陰離子均為ＰＦ 6） 粘 度與陽離子之間的關(guān)系 [32] Fig. The relationship between viscosity cations for ionic liquids with antion PF6[32] 活動性強，由其組成的離子液體粘度相應(yīng)較底，而含更長烷基鏈或氟化烷基鏈的離子液體液體較大，這是因為更強的范得華力作用的結(jié)果。而離子液體作為一種新型的“綠色”共溶劑和試劑，其有著優(yōu)良的性質(zhì)如不容易揮發(fā)、強極性等，反應(yīng)后可以通過 萃取法、蒸餾法、柱層析法和超臨界二氧化碳法 等進行回收重復(fù)利用。 3） 手性藥物。 在過去的 20 年中，手性亞砜化合物作為手性輔助試劑在不對稱合成領(lǐng)域中的應(yīng)用呈指數(shù)級的增長，確立了手性亞砜官能團在碳碳鍵和碳雜鍵的形成過程中是有效的、最通用的手性控制因素之一 [26]。光學(xué)活性的亞 砜 已廣泛被用于手性藥手的合成以及其它不對稱合成中 ,因此，選擇性制備手性亞 砜 具有較大的理論意義和應(yīng)用前景 [24]。高效回收離子液體新技術(shù)的問世將極大地加速與離子液體相關(guān)的研究和應(yīng)用的進程。因此手性離子液體是名符其實的“綠色溶液”，同時其也被廣泛用到各個科學(xué)領(lǐng)域。 2)吡啶離子鍵 [Py]及其衍生物。時至今日離子液體作為一種強勢商品必然有著可觀的 經(jīng)濟 規(guī)模 和效益 。 再到 1996 年， Gratzel 等發(fā)表了有關(guān)含 — CF3和其它氟代烷基離子液體合成和性能的研究。 1914 年首先發(fā)現(xiàn)的離子液體是乙胺硝酸鹽 (EtNH3 人們早已知道手性亞 砜的消旋化能量和消旋溫度較高（分別為 146～ 176KJ/mol 和 200℃） ，所以其在化學(xué)反應(yīng)過程中是比較穩(wěn)定的。 手性藥物具有光學(xué)活性。本文研究苯甲硫醚分別在緩沖溶液、有機溶液、離子液體中的不對稱反應(yīng)規(guī)律，實驗在不同的 PH 值、底物濃度、過氧物化物種類、過氧化物添加方式等條件下進行反應(yīng)。 專業(yè)教研組（系）、研究所負責(zé)人 審核 年 月 日 指導(dǎo)教師 簽發(fā) 年 月 日 畢業(yè)設(shè)計（論文）評語： （ 應(yīng)包括平時表現(xiàn)、論文質(zhì)量、答辯 表 現(xiàn)等內(nèi)容 ） 畢業(yè)設(shè)計（論文）總評成績： 畢業(yè)設(shè)計（論文）答辯負責(zé)人簽字： 年 月 日 I 摘 要 傳統(tǒng)的化學(xué)反應(yīng)和分離過程都是在 有機 溶劑中進行的，由于使用大量易揮發(fā)的有機溶劑，對環(huán)境造成嚴(yán)重的污染。 在所研究的親水性和疏水性離子液體中， [bmim] [bf4] 的底物轉(zhuǎn)化率和和 為最高，達到 和 90% 。 ） 長期以來 人們只能通過一般的化學(xué)方法來獲得手性藥物，得到的產(chǎn)物光學(xué)性 (e 本文主要就在離子液體中通過對潛手性的硫醚進行不對稱氧化生成手性亞 砜 進行實驗， 通過其與傳統(tǒng)的有機不對稱反應(yīng)的對比 對其反應(yīng) 規(guī)律作出一些 初步的研究 。 但其遇水表現(xiàn)得非常不穩(wěn)定，尋找穩(wěn)定的離子液體一直是人們的愿望。在這以后離子液體才得以被廣泛開發(fā)和利用。 1） 極性 ~, 與短鏈醇的極性相似 2） 溶解性 化合物，水，超臨界 CO2 3） 粘度 高 4） 酸堿度 偏酸性，與合成、分離純化方法有關(guān) 5） 穩(wěn)定性 300 oC以上非常穩(wěn)定 6） 熔點 高，與陰陽離子密切相關(guān) 7） 密度 與陰陽離子組成密切相關(guān) [14] 目前，常用的離子液體主要是由咪唑類或吡啶類陽離子和一系列陰離子如四氟硼酸、六氟磷酸等組成的，如 1烷基 3甲基咪唑六氟磷酸。 R4 表示 N 原子上的四個取代基，如二甲基乙基丁基銨可簡記為 [N1124]。調(diào)變化學(xué)性質(zhì)的功能 化離子近年來受到高度重視[18]， 不同官能團的引入實現(xiàn)了離子液體特定的功能化要求，含質(zhì)子酸的離子液體 [19]、含手性中心的離子液體 [20]、具有配體性質(zhì)的離子液體 [21]都已見報道。這無 疑將極大地阻礙相關(guān)的研究和應(yīng)用。 當(dāng)兩個烷基或芳基不同時 ，亞砜就具有光學(xué)活性 。 6 2)手性配體和手性催化劑。其它一些手性亞砜正不斷被開發(fā)成新藥 ,因此亞 砜 類的手性藥物具有極大的經(jīng)濟學(xué)意義。 7 離子液體 中反應(yīng) 的影響 因素 １） 離子液體粘度 和溫度 的影響 。 陰離子 的大小和幾何形狀對離子液體的粘度也有很大的影響， 陽離子為 [C4min]+的離子液體粘度與陰離子的變化關(guān)系如下圖（ ）所示。 在生物催化氧化中， 作為反應(yīng)介質(zhì)的離子液體的 pH和水活度對酶的反應(yīng)有顯著的影響。在線調(diào)控反應(yīng)過程中離子液體的 pH 和水活度新方法的建立將有助于充分發(fā)揮酶在離子液體中的優(yōu)良催化特性。其中含硫化合物的不對稱氧化是最直接的 方 法 。迄今為止 ， 制備光學(xué)活性亞砜的最有效方法是通過對映選擇性的催化劑氧化硫醚 ， 而酶和手性金屬催化劑是高效的對映選擇性催化劑 [4243]。硫醚的不對稱生物催化氧化經(jīng)過近二十年來的探索和研究 ， 已得到了很大的發(fā)展 。 2H2O 溶液，再按表 1 的比例配成不同 pH值的 PBS 緩沖液。 反應(yīng) 在 28℃ 恒溫 水浴鍋中進行，從第一次添加 H2O2 溶液開始計時，分批添加若干次，每次加 5μL，每次時間間隔 1 分鐘。 15 pH 對酶促不對稱氧化反應(yīng)的影響 e . e . s 值S 亞砜產(chǎn)量051015202530354045 7 p H 值e.e值 (%)0123456S亞砜的產(chǎn)量 (μm) 圖 pH 值 對 S型產(chǎn)物產(chǎn)量 和 的影響 Fig Effect of PH on sulfoxidation 通過極差分析，可能清楚的看出 pH 值對反應(yīng)產(chǎn)物 ，僅次于酶量對反應(yīng)的影響，在一定 pH 值范圍內(nèi)，產(chǎn)物 pH 值的升高而下降。 過氧化氫分批不同量添加對酶促不對稱氧化反應(yīng)的影響 .(%)SubstrateConversion(%)30354045505560650 5 10 15 20 25H2O2 Content(%).(%)919293949596Substrate Conversion(%) 圖 過氧化氫分批不同量添加對酶促不對稱氧化反應(yīng)的影響 Fig Effect of H2O2 adding style at the changable concentration on sulfoxidation 用 1mM、 2mM、 3mM、 4mM、 6mM、 8mM、 10mM、 20mM 的 H2O2 在反應(yīng)體系中作氧化劑反應(yīng)。 在得到最佳的 pH 值后，應(yīng)該采取一定的措施保持反應(yīng)體系 PH 的穩(wěn)定性，本實驗采用磷酸緩沖液體系來保持體系 pH 的穩(wěn)定性。 在這里雖然對反應(yīng)的規(guī)律作了一些初步的探索，但當(dāng)中也有一些問題沒能得到很好的解決， 比如 ，還有現(xiàn)在 反應(yīng)反用的 酶價格過貴，對 反應(yīng) 作進一步探索也有一定的經(jīng)濟阻力。 不同配比 異丙醇 /水混合相中的酶促芳香基硫醚不對稱氧化反應(yīng) 在 6個 2ml 具塞離心管中分別加入 1ml 反應(yīng)液 {}，包括 2mM 苯甲硫醚、 19 1mg/ml 辣根過氧化物酶、 3mM H2O2 和適量有機溶劑｛ 1%、 5%、 10%、 20%、 40%、 80%，V/V｝，混合均勻后，置于水浴恒溫振蕩器內(nèi)反應(yīng)（ 28℃、 180 r/min），定時分 別取樣200μL，添加 20μL 的 Na2SO3（ 1mol/L, 溶解于 pH= 的 液）讓酶失活， 再 于通風(fēng)櫥 中 用 乙醚萃取，然后取 20μl 作 HPLC 分析。醇類的 logp 范圍為 ～ 0，用于親脂性底物反應(yīng)，其含量為 1%～50%時，不影響酶的活性。 酶的添加量對越多，后期 ，加上酶的價格過高，加入過多的酶對不符合經(jīng)濟要求， 也對反應(yīng)沒利，應(yīng)該嚴(yán)格控制酶量的添加， 在實驗中酶的添加量 mM 為宜。 說明了酶對反應(yīng)底物的催化反應(yīng)有一定的限度，這可能后期的時候酶受到了過氧化氫或溶劑等物質(zhì)的破壞，使酶部份的 鈍化了或失活了 ，無有能力繼續(xù)進行催化 底物 反應(yīng)。同量的過氧化氫，一次性的加入，過氧化氫會把部份的酶鈍化而使其失活，所以 都會 有所下降 。苯甲硫醚、 R苯甲亞砜、 S苯甲亞砜的保留時間分別為： min、 min 和 ；采用外標(biāo)法，條件穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，平均誤差不超過 %。取 5 支 2ml 具塞離心管分別加入 500μl氧化反應(yīng)體系 ,分別含 苯甲基硫醚溶液（溶解于 異丙醇 ） ， 2mg/ml 辣根過氧化物酶溶液， 6mM 過氧化氫 。 相信隨著手性亞砜誘導(dǎo)的高度立體選擇性反應(yīng)的深入研究 ， 亞砜化合物在不對稱合成中將有更廣闊的應(yīng)用前景。 因此 ， 光學(xué)活性的手性亞砜制備具有重要的理論和實際意義 。 Prasanta Kumar Das 等 [39]研究了α 糜蛋白酶介導(dǎo)的不對稱磺化氧化反應(yīng)，結(jié)果表明，α 糜蛋白酶介導(dǎo)的反應(yīng)無論在產(chǎn)率還是對映選擇性上都比 BSA 介導(dǎo)的要高出許多。目前，提純離子液體的方法主要有兩種： 一）水不溶性的離子液體，先用蒸餾水沖洗，然后真空干燥。因此，準(zhǔn)確控制 pH 值和水活度對離子液體中酶反應(yīng)的研究和應(yīng)用具有重要的意義。 ２） 離子液體表面張力的影響。如下圖（ ）， 從圖中可以看出，隨著烷基鏈長的增加， 離子液體（陰離子為ＰＦ 6）的粘度也相應(yīng)增大， 2者基本上呈線性關(guān)系。這與當(dāng)今社會倡導(dǎo)的綠色科學(xué)、環(huán)保有點不相稱，因為在傳統(tǒng)的不對稱氧化反應(yīng)中所用到的試劑和氧化劑 一般會產(chǎn)生相應(yīng)對環(huán)境有害的殘渣和廢物等。隨著這 類配體合成方法的不斷改進 ， 這類配體將進一步得到發(fā)展。 手性亞 砜 的用途 由于 手性亞 砜 具有高度的光學(xué)活性、較好的手性傳遞性，所以其在手性藥物和其它手性物質(zhì)具有很大的作用和用途 ： 1） 手性輔助試劑和手性中間體。手性亞 砜 具有高度的光學(xué)穩(wěn)定性， 由大多數(shù)亞砜的熱力學(xué)常數(shù)計算表明 ， 亞砜的兩個異構(gòu)體要在 200 ℃左右