【正文】 ： 苯甲基硫醚溶液（溶解于 異丙醇 ） ， 辣根過氧化物酶溶液 （ 、 12 1 mg/ml、 mg/ml、 2 mg/ml） ，過氧化氫（ 2mM、 4mM、 6mM、 8mM） ，在 20℃ 、28℃ 、 36℃ 、 44℃ 恒溫 水浴鍋中 反應(yīng)。 反應(yīng) 在 28℃ 恒溫 水浴鍋中進行，從第一次添加 H2O2 溶液開始計時，分批添加若干次，每次時間間隔 1 分鐘 ,則 5 支管分別添加 5 次 。反應(yīng) 20 分鐘后往各個 樣 （ 200μL）中分別 添加 20μL的 Na2SO3（ 1mol/L, 溶解于 pH= 的 ）讓酶失活，再用 乙醚萃取，然后取 20μl 上清液作 HPLC 分析 。色譜圖見附錄 。然而 pH 值對反應(yīng)產(chǎn)量的正面影響是先升后降。如果分批不同次數(shù)的加入過氧化氫，過氧化氫不會使酶失活，可以很 16 好地使 酶 變成另外的一種構(gòu)型催 化磺化反應(yīng)的進行，所以此時的 更 好的體現(xiàn) ，而且是隨著加入的次數(shù)的增多， ， 但 產(chǎn) 物的轉(zhuǎn)化率卻下降了，這是由于分批加入的過氧化氫 使酶的利用率提高，而氧化劑自發(fā)的氧化作用減弱。 在 1mM～ 6mM 氧化劑之間， . 值隨氧化劑含量的增加而逐漸增大， 在 6mM～ 20mM 氧化劑之間 ，而底物轉(zhuǎn)化率隨氧化劑增加緩慢增大。 考慮到 值和產(chǎn)量因素，底物濃度選在 10mM 為宜。 底物濃度對反應(yīng)的 影響也很大，對轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生一定的影響，底物濃度增大，轉(zhuǎn)化率會有一定的提高，但也不是很明顯，實驗中底物從 1mM 提高到 40mM 時，轉(zhuǎn)化率提高了 5 個百分點左右。 過氧化氫對反應(yīng)的影響是很明顯也是很直接的，一次性地加 入過氧化氫，過量的過氧化氫會使酶總份地失活，從而導(dǎo)致反應(yīng)率的下 降，分批多次的加入過氧化氫的方法可以很好的解決這個問題。希望可以有更廉價的酶對反應(yīng) 可以起作用，這有利于開展 更多量的實驗研究。 故選甲醇（ logp=）、乙醇（ logp=）、異丙醇（ logp=）作為本反應(yīng)的有機溶劑。 結(jié)果與討。 pH 值的影響 取 6 個 10ml 離心管 ,加入 4ml 反應(yīng)液 {}，包括 2mM 苯甲硫醚、 1mg/ml 辣根過氧化物酶、 3mM H2O2 和適量有機溶劑｛ 1%、 5%、 10%、 20%、 40%、 80%， V/V｝，混合均 勻后， 用 pH 計分別測 pH 值。只有在少數(shù)情況下，對強極性底物如多羥基化合物才考慮采用中等極性或與水互溶性溶劑如四氫呋喃等，在這些溶劑中，除 極少數(shù)特別穩(wěn)定的酶如枯草桿菌蛋白酶外，絕大多數(shù)酶都會失活。 本實驗中過氧化氫的添加量為 6mM，分開五次加到反應(yīng)體系中。 綜合考慮 值和產(chǎn)量，本實驗底物濃度選在10mM。 pH 對反應(yīng)的影響特別明顯， pH 的過高或過低對反應(yīng)都非常的不利，應(yīng)該通過重復(fù)多次實驗和正交實驗來確定最佳的反應(yīng)體系 pH 值，本實驗最佳的 pH 是 。 轉(zhuǎn)化率在后期有所提高，但變化也不大，因為在 1mM 時產(chǎn)率為 91%，但底物濃度提高到 40mM 時，產(chǎn)量轉(zhuǎn)化率為 95% 。 所以 為了得到更高的選擇性等綜合因素的考慮，在反應(yīng)中應(yīng)該采取分批次地加入過氧化氫的方法。 過氧化氫的添加方式對 酶促 不對稱氧化反應(yīng)的影響 過氧化氫等量 不同次數(shù)添加對酶促不對稱氧化反應(yīng)的影響 底物轉(zhuǎn)化率（ % ）e . e 值（ % ）0102030405060701 2 3 4 5氧化劑添加次數(shù)e.e.值(%)74757677787980底物轉(zhuǎn)化率(%) 圖 等量過氧化氫分不同次數(shù)添加對不對稱氧化的影響 Fig. Effect of H2O2 adding style at stable concentration on sulfoxidation 在 6mM 濃度下進行， 隨氧化劑添加次數(shù)的增多而增大，而轉(zhuǎn)化率反之 。 過氧 化氫含量對酶促不對稱氧化反應(yīng)的影響 e . e . s 值S 亞砜產(chǎn)量0510152025303540452 4 6 8過氧化氫 ( m M )e.e值 (%)012345678S亞砜的產(chǎn)量 (μm) 圖 H2O2 含量 對 S型產(chǎn)物產(chǎn)量 和 的影響 Fig Effect of H2O2 on sulfoxidation 從圖中看出前期隨著過氧化氫加入量的增多， ，但過氧化氫加入量超過一定的程度， ，這是 由于過量的過氧化物氧化劑會將手性亞砜進一步氧化成砜，故應(yīng)把 H2O2 的含量控制在一定濃度下，從產(chǎn)物產(chǎn)量與對映體過量值綜合考慮， 控制 H2O2 為 6 mM 為 宜 。 、 13 苯甲硫醚標準曲線051015200 1 濃度（m M ）峰面積（AU*S） 圖 為不對稱氧化反應(yīng)底物苯甲硫醚的標準曲線 其回歸方程為 y = + 底物轉(zhuǎn)化率（ %）＝（反應(yīng)前底物濃度 反應(yīng)后底物濃度） /反應(yīng)前底物濃度 100% ％＝ [(SR )/(S+ R )] 100％ 用高效液相色譜檢測反應(yīng)體系中苯甲硫醚、 R苯甲亞砜、 S苯甲亞砜的濃度，分析條件如下： 儀器：高效液相色譜（ HPLC） LC2100， FID 檢測器， 美國 Agilient 公司； 流動相：異丙醇 /正已烷 (15/85,v/v)；流速： ml/min；柱溫： 30℃；進樣量： 20μL ；手性色譜柱： Chiralcel ODH（ 15cm）；檢測波長為 242 nm。 過氧化氫分批不同量添加對酶促不對稱氧化反應(yīng)的影響 再取 500ul氧化反應(yīng)體系中含： 苯甲基硫醚溶液（溶解于 異丙醇 ） ， 2mg/ml辣根過氧化物酶溶液， 適量 過氧化氫 （ 1mM、 2mM、 3mM、 4mM、 6mM、 8mM、 10mM、20mM）。 過氧化氫等量不同次數(shù)添加對酶促不對稱氧化反應(yīng)的影響 通過多因素多水平分析，選取一個底物相 對酶過量的反應(yīng)體系來探索酶與氧化劑的最適比例。 12H2O 和 NaH2PO4 酶催化各種硫化物氧化獲得手性亞砜及其絕對構(gòu)型的新技術(shù)突破了天然酶源的局限性 ， 為發(fā)展更多性能更加優(yōu)良的酶或新功能酶提供了條件； 10 預(yù)計在今后的十來年內(nèi) ， 將會有更多優(yōu)于傳統(tǒng)化學(xué)路線的 生物催化方法被廣泛應(yīng)用于各種精細化學(xué)品的工業(yè)生產(chǎn)中 。近 20 多年來對映選擇性氧化硫醚發(fā)展很 迅速 ， 手性催化劑已經(jīng)涉及多種微生物的多種過氧化物酶。 目前許多生物活性分子中都含有一個亞磺酰的立體中心結(jié)構(gòu) ， 而且立體化學(xué)不同的對映體可能具有不同的生理活性及代謝作用 。 其制備方法主要分為以下幾類 : (1)化學(xué)及酶拆分消旋體亞砜化合物 ； (2)硫醚的酶催化氧化 ； (3)硫醚的非對映選擇性氧化 ； (4)手性氧化劑對映選擇性氧化硫醚 ；(5)手性金屬絡(luò)合物誘導(dǎo)的硫醚的不對稱氧化 ； (6)手性亞磺酰衍生物的親核取代 ； (7)水解手性螺環(huán) η 4硫化合物 ； (8)手性金屬絡(luò)合物催化硫醚不對稱氧化等方法 [41]。 Sergei 等 [38]報道了許多具有催化非天然、非生 9 理，立體選擇性的轉(zhuǎn)化過程能力的酶和 非酶蛋白在有機化學(xué)中都很有用：例如，辣根過氧化酶能催化酚類物質(zhì)，又能催化各類與其非相關(guān)的反應(yīng)，包括不對稱的磺化氧化反應(yīng)和過氧化物還原反應(yīng)；普遍存在的牛血清白蛋白雖然不具有催化功能，但是也能催化不對稱磺化氧化反應(yīng)。 手性亞砜的合成方法 制備光學(xué)活性的 手性亞砜 有好多種主法，主要有：手性拆分，硫醚的不對稱氧化和合成。獲得高純度的離子液體是離子液體用于生物催化的首要條件。由于一些離子液體能溶解大量無機鹽化合物 ，后一種方法難以被廣泛地采用。當然，離子液體中水活度過低，酶將難以維持其活性構(gòu)象、發(fā)揮催化作用。 ３） ＰＨ 和水活度 的影響。因為 其性質(zhì) 是可調(diào)的，所以其也被稱為“設(shè)計者”的溶劑。所以可以通過提高溫度來降低離子液體的粘度，但反應(yīng)物 的對映體選擇性一般隨之下降。 陽離子的結(jié)構(gòu)對離子液體粘度的影響也是比較大的 ，這主要是由氫鍵和范得華力來決定的 [3136]。 本文也將就在離子液體中對硫醚的不對稱氧化生成手性亞砜的反應(yīng)作一些驗證性的實驗和探究 。 但對于不對稱氧化的研究一直集中在有機化學(xué)方學(xué)方面，而在離子液 體中進行不對稱氧化反應(yīng)的相關(guān)研究和反應(yīng)規(guī)律卻不多。 Esomeprazole 是 S構(gòu)型的奧美拉唑 ， 比消旋體具有更佳的療效和更小的個體差異性 ， 以其卓著的品質(zhì)名列 20xx 年全球暢銷藥物第 5 位 ， 銷售額高達 43 億美元。亞磺?；鶃啺芬呀?jīng)被發(fā)展成易制和高效的手性配體 ， 例如雙亞磺?；鶃啺?BISOX 2（圖 ） 在雜 DielsAlder 反應(yīng)取得 98 %ee 。 我國黃量 、周維善、李焰、白東魯、曾志宏等課題組在這方面已經(jīng)做了不少工作 [27]。通過選用不同的反應(yīng)條件 ， 可分別合成 出兩種構(gòu)型的對映體 [25]。引言中提到 手性亞 砜 是一種具有弧電子對，結(jié)構(gòu)是呈錐形結(jié)構(gòu)的物質(zhì)， 與其它手性基團相比 ， 它至少有三個具有明顯位阻和電子差異的取代基 ， 即氧原子 ， 孤對電子 ， 兩個烷基或芳基 。 手性亞 砜 的性質(zhì) 1）手性亞 砜 具有光學(xué)活性。 在生物催化不對稱氧化反應(yīng) 5 方面，還是缺少 研究離子液體與酶分子的相互作用，闡明離子液體對酶分子構(gòu)象的影響規(guī)律 ,進而揭示離子液體對酶反應(yīng)特性影響之分子基礎(chǔ)的報道。因此，欲將離子液體應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，除了降低離子液體的生產(chǎn)成本，還必須很好 地解決離子液體的回收及循環(huán)使用這一重要問題。其的物理和化學(xué)性質(zhì)都會因人們的需要而進行調(diào)整和改變。手性離子除具有一般手性物體的功能特征外，還具有一般液體材料沒有的優(yōu)異特性，如： [15] 1) 較低的揮發(fā)性和在常溫下幾乎觀察不到的蒸汽壓； 2) 非易燃性； 3) 對許多有機和無機手有良好的溶解性； 4) 是一類極性的、非配位的溶劑； 5) 有非常寬的液態(tài)范圍； 6) 可通過選擇陰、陽離子對其理化性質(zhì)進行調(diào)控。 3）季銨離子 [R4N]+。 常規(guī)離子 液體的陽離子一般為含有 N或 P的有機大離子，其中季銨類離子包括 [16]： 1）咪唑離子 [im]+及其取代衍生物。 離子液體的理化性質(zhì) 離子液體的理化性質(zhì)對以其為反應(yīng)介質(zhì)進行的生物、化學(xué)反應(yīng)有著重要的影響， 3 其熔點、熱穩(wěn)定性、溶解性能、粘度、密度、極性等與反應(yīng)溫度、反應(yīng)速度、反應(yīng)的選擇性、反應(yīng)器的形式及產(chǎn)品與離子液體的分離等密切相關(guān)。 目前離子液體不再只是實驗室用樣品，默克（ Merk）等許多公司已經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)離子液體作為商品出售， Merk 公司的產(chǎn)品多達 150 種。同時這類離子液體具有低的黏度、高的電導(dǎo)率、高的熱穩(wěn)定性等優(yōu)良性能 [8]。在 1992 年，當 Wilkings 和 Zaworotko 合成四氟硼酸鹽離子液體時，才意 味著第二代離子液體的產(chǎn)生，同時也是離子液體方法的誕生[10]。 20 世紀 40 年代， Hurey等在尋找一種溫和的混合物電解 Al2O3時，把 N甲基吡啶加入 AlCl3中，兩個固體的混合物在加熱后變成了無色透明的液體，這一偶然的發(fā)現(xiàn)構(gòu)成了當今離子液體的原型，即第一代離子液體 [8]。隨著人們對離子液體的深入研究，人們認為把熔點定義在室溫附近太狹窄，有些離子化合物的熔點高于室溫但低于水的沸點。 圖（ 1） 而離子液體作為一種高效的共溶劑和溶劑，由于其在反應(yīng)中表現(xiàn)出來的良好性質(zhì)，不容易揮發(fā)、強極性、疏水性等。而在這一領(lǐng)域中，硫醚的不對稱氧化反應(yīng)一直愛到廣泛的關(guān)注。只有含有手性碳的分子才具有光學(xué)活性 [4]。手性對映體在性質(zhì)上往往表示出差異，有時甚至表現(xiàn)出百花截然不同的性質(zhì) [12]。 在幾種有機溶劑反應(yīng)體系中， 異丙醇 的底物轉(zhuǎn)化率和 ，達到 60%和 91%。 近年來，離子液體被廣泛關(guān)注，其在各方面的應(yīng)用的報道日益增多 ， 尤其是在 作為 生物催化 反應(yīng)的溶劑和共溶劑更是備受關(guān)注。 本科畢業(yè)設(shè)計（論文）說明書 離子液體中 苯甲硫醚 不對稱氧化規(guī)律的研究 學(xué) 院 生物科學(xué)與工程學(xué)院 專 業(yè) 生物制藥工程 學(xué)生姓名 MR LIANG 指導(dǎo)教師 王菊芳 提交日期 20xx 年 6 月 6 日 華 南 理 工 大 學(xué) 畢 業(yè) 設(shè) 計 （論文） 任 務(wù) 書 茲發(fā)給 05 生物制藥 班學(xué)生 MR L