【正文】 在 6 個(gè) 2ml 具塞離心管中分別加入 1ml 反應(yīng)液 {}，包括 2mM 苯甲硫醚、1mg/ml 辣根過氧化物酶、 3mM H2O2 和 10 %有機(jī)溶劑｛ 甲醛、 甲醇、乙醇、異丙醇 、乙腈、丙酮 ｝， 混合均勻后，置于水浴恒溫振蕩器內(nèi)反應(yīng)（ 28℃、 180 r/min），定時(shí)分 別取樣 200μL，添加 20μL的 Na2SO3（ 1mol/L, 溶解于 pH= 的 鹽緩沖溶液）讓酶失活，再 于通風(fēng)櫥中 用 乙醚萃取，然后取 20μl 作 HPLC 分析。 同量的過氧化氫分開加入的次數(shù)越多， .值越高，但轉(zhuǎn)化率有一定的下降，是因?yàn)槊恳淮渭尤氲倪^氧化氫都會(huì)把一定的產(chǎn)物亞砜氧化成砜。 結(jié)論與展望 在 不對稱反應(yīng) 中，反應(yīng)的影響因素 有很 多 ，包括 反應(yīng)體系的 pH、底物濃度、酶的添加量、過氧化氫的添加量和添加方式等。 把部分的產(chǎn)物徹底 氧化成了其它物質(zhì)（砜）等。 結(jié)果與討論 不對稱氧化反應(yīng)條件的確定 酶含量對酶促不對稱氧化反應(yīng)的影響 14 e . e . s 值S 亞砜的產(chǎn)量051015202530354045 1 2酶量 ( m g / m l )e.e.s值( %)012345678S亞砜的產(chǎn)量 (μm) 圖 為酶含量對 S型產(chǎn)物產(chǎn)量 和 的影響 Fig Effect of enzyme on sulfoxidation 通過對 S型產(chǎn)物產(chǎn)量和 ，當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí)，酶加的越多，產(chǎn)物的產(chǎn)量也越大，但是當(dāng)酶含量越過一定范圍時(shí)，產(chǎn)物的 ， 雖然產(chǎn)量在圖中并沒有很大 的變化 ，但 純酶價(jià)格昂貴，故要嚴(yán)格控制酶的添加量，每毫摩爾底物加入 ～ 2mg/250ul 酶粉 為宜。反應(yīng) 20 分鐘后往各個(gè) 樣（ 200μL）中分別 添加 20μL的 Na2SO3（ 1mol/L, 溶解于 pH= 的 緩沖溶液）讓酶失活，再用 乙醚萃取，然后取 20μl上清液作 HPLC 分析。 11 第二章 緩沖液中 HRP 促 甲基苯 基 硫醚不對稱氧化反應(yīng)的研究 實(shí)驗(yàn)材料 與方法 辣根過氧化物酶；苯甲硫醚（ Methyl phenyl sulfide）純度 99%以上，購自 Sigma 公司；苯甲基亞砜（ Methyl phenyl sulfoxide）純度 97%以上，購自 Aldrich 公司；甲醇、異丙醇、乙醇 高效液相色譜（ HPLC）： LC2100， FID 檢測器， 美國 Agilient 公司 手性柱： Chiralcel ODH， 15cm, Daicel 化學(xué) 公司 通風(fēng)櫥： P1168,雷蒙特科學(xué)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司 臺(tái)式水浴恒溫振蕩器： SHZ88，江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)： Sigma 3K30，德國 Sigma 公司 電子天平： Sartorius CP225D，德國 微量移液器： Eppendorf，德國 冰箱： Hualing BCD182W，中國雪柜實(shí)業(yè)有限公司 pH計(jì)： PB20, 德國 Sartorius 實(shí)驗(yàn)方法 取 4℃下保存的 HRP 酶粉適量，加不同 pH 值的 PBS 緩沖液配成所需濃度的酶液；用 30%的 H2O2 加入緩沖液配成濃度為 H2O2 溶液備用；配制 磷酸鹽緩沖液，先各配 的 Na2HPO4而獲得亞砜的方法 中，不對稱 催化亞砜化是最符合原子經(jīng)濟(jì)性的方法。 近 20 多年 ， 手性亞砜的制備方法一直是非?；钴S的研究領(lǐng)域 ， 并得到了很大的發(fā)展 。 因此，開發(fā) 高效、低成本的離子液體純化新技術(shù)也必將大有可為。目前，一般采用飽和鹽水溶液氣相平衡方法來控制離子液體中的水活度，也有通過在反應(yīng)體系中添加水合鹽來控制離子液體中的水活度。另外，陽離子對離子液體的表面張力也有一定的影響，隨著烷基鏈的增長，離子液體的表面張力相應(yīng)地降低 [36]。同時(shí)，溫度對離子液體粘度的影響也比較大，隨著溫度的升高，離子液體的粘度減小 [33]。 雖然目前 可能對離子 液體 的回收問題也是需要面對的問題之一，但這個(gè)方向?qū)?huì)得到更多的關(guān)注。 Esomeprazole 3（圖 ） 為代表的一系列質(zhì)子泵抑制劑 ， 都是手性雜環(huán)基亞砜類化合物。 手性亞砜除了作為手性輔助劑在不對稱合成中的用途，作為手性中間體也是其很重要的一個(gè)方面，其良好的手性傳遞性引起了很多科學(xué)工作者的關(guān)注。 2）手性亞 砜 具有較好的手性傳遞性。 離子液體發(fā)展的瓶頸 離子液體雖然作為一種新式的反應(yīng)介質(zhì)被上重視起來，但在離子液體中發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)過程非常復(fù)雜，很多的機(jī)理還沒被很好的搞清楚。 功能化離子液體 離子液體被稱為“設(shè)計(jì)者的溶劑” [17]， 原因就是離子液體是一類特殊的液體熔融鹽，具有優(yōu)良的物理化學(xué)性質(zhì)以及可以可修飾、調(diào)變的陰陽離子結(jié)構(gòu)，這種離子液體經(jīng)過設(shè)計(jì)而滿足特定需求的專一的離子液體就是功能化的了。吡啶離子的 N 原子上有取代基 R 則記為 [Rpy]+。 離子液體的概念 離子液體（ Ionic liquids）是由有機(jī)陽離 子和無機(jī)或有機(jī)陰離子構(gòu)成的、在室溫或較低溫（ 100℃）下呈液態(tài)的鹽類，通常稱為室溫離子液體 (Roomtemperature ionic liquids)。這類離子液體對水穩(wěn)定，不發(fā)生水解反應(yīng)，即使將 [BMIM][(CF3SO2)2N]與過量水于 100℃反應(yīng) 24H 小時(shí)也未發(fā)現(xiàn)分解現(xiàn)象。NO3)。手性亞 砜 可以 作為手性輔劑和中間體用于合成復(fù)雜的手性天然物；作為手配體或手性催化劑用于多種不對稱催化反應(yīng)；作為手性藥物用于治療胃潰瘍的質(zhì)子泵抑制劑（如 esomeprazole）等 [7]。（ 一個(gè)物質(zhì)旋轉(zhuǎn) 偏振光 振動(dòng)平面的 能力 稱為光學(xué)活性，而該物質(zhì)被稱為光學(xué)活性物質(zhì)。研究結(jié)果表明， 當(dāng) pH 為 ，底物濃度為 10mM，過氧化氫添加量為6mM，且過氧化氫分 5 次添加時(shí)底物轉(zhuǎn)化率和 。 本科畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）說明書 離子液體中 苯甲硫醚 不對稱氧化規(guī)律的研究 學(xué) 院 生物科學(xué)與工程學(xué)院 專 業(yè) 生物制藥工程 學(xué)生姓名 MR LIANG 指導(dǎo)教師 王菊芳 提交日期 20xx 年 6 月 6 日 華 南 理 工 大 學(xué) 畢 業(yè) 設(shè) 計(jì) （論文） 任 務(wù) 書 茲發(fā)給 05 生物制藥 班學(xué)生 MR LIANG 畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）任務(wù)書，內(nèi)容如下： （論文）題目： 離子液體中苯甲硫醚不對稱氧化反應(yīng)規(guī)律的研究 ： （ 1） 不對稱氧化反應(yīng)的正交實(shí)驗(yàn) （ 2） 有機(jī)溶劑中各因素對硫醚不對稱氧化反應(yīng)的影響 （ 3） 離子液體中各因素對硫醚不對稱氧化反應(yīng)的影響 （ 4） 緩沖液中各因素對硫醚不對稱氧化反應(yīng)的影響 （ 5）總結(jié) 反應(yīng)體系中不同條件對不對氧化反應(yīng)的 影響規(guī)律 ： （ 1） 王軍 .離子液體的性能及應(yīng)用 .中國紡織出版社 . （ 2） 張鎖江 ,呂興梅等 .離子液體 — 從基礎(chǔ)研究到工業(yè)應(yīng)用 .科學(xué)出版社 . （ 3） 付建龍 .有機(jī)化學(xué)教程 ,北京 :化學(xué)工業(yè)出版社 （ 4） 符冠燁 .手性亞砜的合成及其在不對稱合成中的應(yīng)用 （ 5） 官斌，孟慶偉，高占先 .有機(jī)催化的不對稱反應(yīng) . （ 6） （ 7） （論文）任務(wù)書于 年 月 日發(fā)出，應(yīng)于 年 月 日前完成，然后提交畢業(yè)考試委員會(huì)進(jìn)行答辯 。 在幾種有機(jī)溶劑反應(yīng)體系中， 異丙醇 的底物轉(zhuǎn)化率和 ，達(dá)到 60%和 91%。只有含有手性碳的分子才具有光學(xué)活性 [4]。 圖（ 1） 而離子液體作為一種高效的共溶劑和溶劑，由于其在反應(yīng)中表現(xiàn)出來的良好性質(zhì)，不容易揮發(fā)、強(qiáng)極性、疏水性等。 20 世紀(jì) 40 年代， Hurey等在尋找一種溫和的混合物電解 Al2O3時(shí)，把 N甲基吡啶加入 AlCl3中，兩個(gè)固體的混合物在加熱后變成了無色透明的液體，這一偶然的發(fā)現(xiàn)構(gòu)成了當(dāng)今離子液體的原型，即第一代離子液體 [8]。同時(shí)這類離子液體具有低的黏度、高的電導(dǎo)率、高的熱穩(wěn)定性等優(yōu)良性能 [8]。 離子液體的理化性質(zhì) 離子液體的理化性質(zhì)對以其為反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行的生物、化學(xué)反應(yīng)有著重要的影響， 3 其熔點(diǎn)、熱穩(wěn)定性、溶解性能、粘度、密度、極性等與反應(yīng)溫度、反應(yīng)速度、反應(yīng)的選擇性、反應(yīng)器的形式及產(chǎn)品與離子液體的分離等密切相關(guān)。 3）季銨離子 [R4N]+。其的物理和化學(xué)性質(zhì)都會(huì)因人們的需要而進(jìn)行調(diào)整和改變。 在生物催化不對稱氧化反應(yīng) 5 方面，還是缺少 研究離子液體與酶分子的相互作用，闡明離子液體對酶分子構(gòu)象的影響規(guī)律 ,進(jìn)而揭示離子液體對酶反應(yīng)特性影響之分子基礎(chǔ)的報(bào)道。引言中提到 手性亞 砜 是一種具有弧電子對，結(jié)構(gòu)是呈錐形結(jié)構(gòu)的物質(zhì)， 與其它手性基團(tuán)相比 ， 它至少有三個(gè)具有明顯位阻和電子差異的取代基 ， 即氧原子 ， 孤對電子 ， 兩個(gè)烷基或芳基 。 我國黃量 、周維善、李焰、白東魯、曾志宏等課題組在這方面已經(jīng)做了不少工作 [27]。 Esomeprazole 是 S構(gòu)型的奧美拉唑 ， 比消旋體具有更佳的療效和更小的個(gè)體差異性 ， 以其卓著的品質(zhì)名列 20xx 年全球暢銷藥物第 5 位 ， 銷售額高達(dá) 43 億美元。 本文也將就在離子液體中對硫醚的不對稱氧化生成手性亞砜的反應(yīng)作一些驗(yàn)證性的實(shí)驗(yàn)和探究 。所以可以通過提高溫度來降低離子液體的粘度，但反應(yīng)物 的對映體選擇性一般隨之下降。 ３） ＰＨ 和水活度 的影響。由于一些離子液體能溶解大量無機(jī)鹽化合物 ，后一種方法難以被廣泛地采用。 手性亞砜的合成方法 制備光學(xué)活性的 手性亞砜 有好多種主法，主要有：手性拆分，硫醚的不對稱氧化和合成。 其制備方法主要分為以下幾類 : (1)化學(xué)及酶拆分消旋體亞砜化合物 ； (2)硫醚的酶催化氧化 ； (3)硫醚的非對映選擇性氧化 ； (4)手性氧化劑對映選擇性氧化硫醚 ；(5)手性金屬絡(luò)合物誘導(dǎo)的硫醚的不對稱氧化 ； (6)手性亞磺酰衍生物的親核取代 ； (7)水解手性螺環(huán) η 4硫化合物 ； (8)手性金屬絡(luò)合物催化硫醚不對稱氧化等方法 [41]。近 20 多年來對映選擇性氧化硫醚發(fā)展很 迅速 ， 手性催化劑已經(jīng)涉及多種微生物的多種過氧化物酶。 12H2O 和 NaH2PO4 過氧化氫分批不同量添加對酶促不對稱氧化反應(yīng)的影響 再取 500ul氧化反應(yīng)體系中含： 苯甲基硫醚溶液（溶解于 異丙醇 ） ， 2mg/ml辣根過氧化物酶溶液， 適量 過氧化氫 （ 1mM、 2mM、 3mM、 4mM、 6mM、 8mM、 10mM、20mM）。 過氧 化氫含量對酶促不對稱氧化反應(yīng)的影響 e . e . s 值S 亞砜產(chǎn)量0510152025303540452 4 6 8過氧化氫 ( m M )e.e值 (%)012345678S亞砜的產(chǎn)量 (μm) 圖 H2O2 含量 對 S型產(chǎn)物產(chǎn)量 和 的影響 Fig Effect of H2O2 on sulfoxidation 從圖中看出前期隨著過氧化氫加入量的增多， ，但過氧化氫加入量超過一定的程度， ，這是 由于過量的過氧化物氧化劑會(huì)將手性亞砜進(jìn)一步氧化成砜，故應(yīng)把 H2O2 的含量控制在一定濃度下，從產(chǎn)物產(chǎn)量