細(xì)胞與分子生物學(xué)(更新版)
【正文】 1 cycles 68℃ 7 min。(6）下膠：（同測(cè)序膠）(7）干膠：在膠表面覆上保鮮膜，80℃干膠30min。6．以PCR產(chǎn)物為探針，標(biāo)記后進(jìn)行Northern雜交，證實(shí)基因的真實(shí)性。8．DNA序列測(cè)定。圖26顯示了ddPCR放射自顯影的X光片5．差異條帶回收再擴(kuò)增(1）X光片經(jīng)D72顯影、酸性定影液定影后，水洗晾干。 4．電泳和放射自顯影(1）配制6%變性聚丙烯酰胺凝膠，灌注測(cè)序板。(10)將72μl ddH2O分別加入A管中，混勻。PC為陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)普通脂糖凝膠電泳可以檢測(cè)PCR產(chǎn)物，且脂糖凝膠電泳顯示的條帶可以直接用于Northern 雜交分析。該方法則可較好地消除初始反應(yīng)的非特異性[8]。近些年來(lái)，在分離和克隆差異表達(dá)基因的功能基因組學(xué)研究中，國(guó)內(nèi)外學(xué)者又發(fā)展了多種分析方法，如，代表性差異分析、RNA 指紋技術(shù)、RC4D、SAGE、抑制消減雜交技術(shù)、cDNAAFLP、iAFLP及基因芯片技術(shù)等方法克隆差異表達(dá)基因[4]。mRNA差別顯示技術(shù)(DDRTPCR)是目前有效篩選、分離差異表達(dá)基因的方法之一。這些技術(shù)的原理和優(yōu)缺點(diǎn)比較已有許多綜述總結(jié)。3＇端部分是核心部分，是一段基因特異性結(jié)合段，能與模板完全互補(bǔ)，但長(zhǎng)度較短（10bp）左右，這個(gè)長(zhǎng)度的核酸退火溫度基本在37℃左右，也就是普通隨機(jī)引物的退火溫度；中間調(diào)節(jié)的部分為多聚脫氧次黃苷[poly(dI)]，一般由5個(gè)脫氧次黃苷(dI)組成，在控制引物的退火溫度時(shí)起著關(guān)鍵的作用[9]。[12] 速度快、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠ACP技術(shù)在較短時(shí)間內(nèi)就可克隆到可信的差異表達(dá)基因，且不需要花大量的時(shí)間來(lái)排除假陽(yáng)性。(4）準(zhǔn)備dNTP mix (以5管為例 ) 每管 5管 5第一鏈緩沖液 2μl 10μl dNTPmix（各5mM） 2μl 10μl MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200u/μl） 1μl 5μl 總 5μl 25μl(5）每管加入5μl，混勻后稍離心。③ 將17μl PCR混合液加入各反應(yīng)管，則各管總體積為20μl。立即置冰浴。(3) 以原引物擴(kuò)增： 回收DNA 7 μl 10PCR buffer 5 μl 5mM dNTPmix μl 引物P μl 引物T μl Taq酶 2 μl 加ddH2O至總體積 50μl（4）執(zhí)行PCR程序: 93℃ 3min；93℃ 1min→60℃1min→68℃2min，20次循環(huán)；68℃5mi
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