細(xì)胞與分子生物學(xué)-預(yù)覽頁(yè)
【正文】 結(jié)構(gòu)的優(yōu)化非常重要。近些年來(lái)，在分離和克隆差異表達(dá)基因的功能基因組學(xué)研究中，國(guó)內(nèi)外學(xué)者又發(fā)展了多種分析方法，如，代表性差異分析、RNA 指紋技術(shù)、RC4D、SAGE、抑制消減雜交技術(shù)、cDNAAFLP、iAFLP及基因芯片技術(shù)等方法克隆差異表達(dá)基因[4]。就DDRTPCR的基本原理簡(jiǎn)要概述，闡明了該技術(shù)在生物生長(zhǎng)發(fā)育、雜種優(yōu)勢(shì)、抗逆性基因研究中的應(yīng)用等。mRNA差別顯示技術(shù)(DDRTPCR)是目前有效篩選、分離差異表達(dá)基因的方法之一。它第一次實(shí)現(xiàn)了同時(shí)快速靈敏地檢測(cè)到真核細(xì)胞中大部分的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄體的目的[3]。這些技術(shù)的原理和優(yōu)缺點(diǎn)比較已有許多綜述總結(jié)。作者將介紹一種在DDRTPCR 基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的對(duì)差異表達(dá)基因克隆的新方法，即引物退火控制技術(shù)(Annealling ControlPrimer, ACP）。3＇端部分是核心部分，是一段基因特異性結(jié)合段，能與模板完全互補(bǔ)，但長(zhǎng)度較短（10bp）左右，這個(gè)長(zhǎng)度的核酸退火溫度基本在37℃左右，也就是普通隨機(jī)引物的退火溫度；中間調(diào)節(jié)的部分為多聚脫氧次黃苷[poly(dI)]，一般由5個(gè)脫氧次黃苷(dI)組成，在控制引物的退火溫度時(shí)起著關(guān)鍵的作用[9]。[10]只需通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳就足以進(jìn)行分析ACP技術(shù)顯著提高了PCR 擴(kuò)增的特異性和敏感性，使得PCR產(chǎn)物的特異性大為增強(qiáng)。[12] 速度快、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠ACP技術(shù)在較短時(shí)間內(nèi)就可克隆到可信的差異表達(dá)基因，且不需要花大量的時(shí)間來(lái)排除假陽(yáng)性。將管標(biāo)號(hào)為1A,2A,PC A等。(4）準(zhǔn)備dNTP mix (以5管為例 ) 每管 5管 5第一鏈緩沖液 2μl 10μl dNTPmix（各5mM） 2μl 10μl MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200u/μl） 1μl 5μl 總 5μl 25μl(5）每管加入5μl，混勻后稍離心。(9) 將78μl ddH2O分別加入B管中,混勻。③ 將17μl PCR混合液加入各反應(yīng)管，則各管總體積為20μl。⑥ 反應(yīng)結(jié)束后置20℃保存?zhèn)溆?。立即置冰浴?8)X光片70℃曝光過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間(根據(jù)射線強(qiáng)度而定)。(3) 以原引物擴(kuò)增： 回收DNA 7 μl 10PCR buffer 5 μl 5mM dNTPmix μl 引物P μl 引物T μl Taq酶 2 μl 加ddH2O至總體積 50μl（4）執(zhí)行PCR程序: 93℃ 3min；93℃ 1min→60℃1min→68℃2min，20次循環(huán)；68℃5min。7．PCR產(chǎn)物的TA克
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