【正文】 時(shí)應(yīng)形成白色絮狀沉淀。 　　取上層水相, 加入等體積氯仿,振蕩混勻,4℃下12000g離心10分鐘。 　　[注意] 1. 提取過(guò)程中應(yīng)盡量保持低溫。該系統(tǒng)不需要酚和氯仿抽提,純化后的DNA溶于水或TE緩沖液中，不含任何鹽份，可以直接用于DNA序列分析和酶切反應(yīng)，也可以用于在核酸酶抑制劑（如RNasin）存在的條件下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)等。 　　 加15ml中和溶液,立即反復(fù)倒置離心管數(shù)次，并使之混勻。 　　 棄上清,懸浮DNA沉淀于2ml TE緩沖液中。 　　將樹(shù)脂/DNA混合液轉(zhuǎn)入柱子中,真空抽取樹(shù)脂/DNA混合液。 　　1 加入5ml 80％乙醇漂洗柱中的樹(shù)脂, 柱子真空抽干后將柱子放入用戶提供的離心管中,2500rpm(1300g)離心5分鐘?！　注意] 1. 在使用之前,系統(tǒng)所提供的柱子洗脫液按1:1加入125ml 95％乙醇。 　　將Sepharose % SDS的TE（）平衡后上柱。 　　對(duì)每一管測(cè)定其OD260值,以確定哪些管中含有質(zhì)粒DNA。 　　沉淀加70%乙醇洗滌,4℃下12000g離心10分鐘,棄去上清液。 第二章 DNA酶切及凝膠電泳第一節(jié) 概 述 　　一. DNA的限制性內(nèi)切酶酶切分析 　　限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱(chēng)為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上,并切割雙鏈DNA。 另一種為獨(dú)立的甲基化酶,它修飾同一識(shí)別序列。),有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列。有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱(chēng)軸一側(cè),產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱(chēng)粘性未端, 如EcoRⅠ切割識(shí)別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端?！?G AATTC…339?！?CTTAA G…539。如果采用兩種限制性內(nèi)切酶,必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。 　　DNA限制性內(nèi)切酶酶切圖譜又稱(chēng)DNA的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。酶切圖譜的使用價(jià)值依賴于它的準(zhǔn)確性和精確程度。但要完全酶解則必須增加酶的用量,一般增加23倍,甚至更多,反應(yīng)時(shí)間也要適當(dāng)延長(zhǎng)。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆操作。聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5500bp)效果較好,其分辯力極高,甚至相差1bp的DNA片段就能分開(kāi)。 　　瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì),其密度取決于瓊脂糖的濃度。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時(shí),可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收,用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。 　　嵌入染料的存在 　　熒光染料溴化乙啶用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng),還會(huì)使線狀DNA遷移率降低15％。 第二節(jié) 材料、設(shè)備及試劑 　　一、 材料 　　λDNA: 購(gòu)買(mǎi)或自行提取純化。瓊脂糖(Agarose): 進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)的電泳用瓊脂糖均可。 　　 溴化乙錠(EB)溶液母液:將EB配制成10mg/ml,用鋁箔或黑紙包裹容器,儲(chǔ)于 室溫即可。 　　 混勻反應(yīng)體系后,將eppendorf管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?37℃水浴保溫23小時(shí),使酶切反應(yīng)完全。HindIII切割 DNA后得到8個(gè)片段, , , , , , 。加熱過(guò)程中要不時(shí)搖動(dòng),使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。 向冷卻至5060℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB) /ml(也可不把EB加入凝膠中,)。因邊緣效應(yīng)樣品槽附近會(huì)有一些隆起,阻礙緩沖液進(jìn)入樣品槽中,所以要注意保證樣品槽中應(yīng)注滿緩沖液。 　　 電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源。 　　 觀察和拍照：在波長(zhǎng)為254nm的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。 　　 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：在放大的電泳照片上,以樣品槽為起點(diǎn),用卡尺測(cè)量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的遷移距離,以厘米為單位。 　　 DNA酶切片段排列順序的確定：根據(jù)單酶切,雙酶切和多酶切的電泳分析結(jié)果,對(duì)照DNA酶切片段大小的數(shù)據(jù)進(jìn)行邏輯推理,然后確定各酶切片段的排列順序和各酶切位點(diǎn)的相對(duì)位置。反應(yīng)液中加入過(guò)量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)。從膠上回收DNA時(shí),應(yīng)盡量縮短光照時(shí)間并采用長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈(300360nm）,以減少紫外光切割DNA。 第三章 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化第一節(jié) 概 述 　　在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過(guò)細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi),但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中,一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因,因此不能自行完成從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法(如電擊法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化學(xué)試劑法)的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenent cells)。為了提高轉(zhuǎn)化效率, 實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素： 　　1. 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度: 不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于４℃的培養(yǎng)菌，最好從－70℃或20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液?！　?. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。 　　3. 試劑的質(zhì)量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是最高純度的(.),并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。如受體細(xì)胞沒(méi)有轉(zhuǎn)入pBS，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。由于pBS質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr )，可通過(guò)Amp抗性來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子。 第二節(jié) 材料、設(shè)備及試劑 　　一. 材料　　E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS質(zhì)粒DNA: 購(gòu)買(mǎi)或?qū)嶒?yàn)室自制，eppendorf管。 　　:將配好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60℃左右,加入Amp儲(chǔ)存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻后鋪板。 第三節(jié) 操作步驟 　　一、 受體菌的培養(yǎng) 　　從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α單菌落,接種于35ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)左右,直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。 　　棄去上清,加入4ml預(yù)冷含15%,輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。 　　42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘,熱擊后迅速置于冰上冷卻35分鐘。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應(yīng)沒(méi)有菌落出現(xiàn)。但它們的轉(zhuǎn)化效率并不一定一樣?？傊甤DNA的合成和克隆已成為當(dāng)今真核分子生物學(xué)的基本手段。由于mRNA分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),容易受RNA酶的攻擊反應(yīng)而降解,加上RNA酶極為穩(wěn)定且廣泛存在,因而在提取過(guò)程中要嚴(yán)格防止RNA酶的污染,并設(shè)法抑制其活性,這是本實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。DEPC是RNA酶的化學(xué)修飾劑,它和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性。Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌?！　〖?xì)胞內(nèi)總RNA制備方法很多,如異硫氰酸胍熱苯酚法等。經(jīng)過(guò)兩次oligo(dT)纖維素柱,可得到較純的mRNA。AMV反轉(zhuǎn)錄酶包括兩個(gè)具有若干種酶活性的多肽亞基,這些活性包括依賴于RNA的DNA合成,依賴于DNA的 DNA合成以及對(duì)DNA:RNA雜交體的RNA部分進(jìn)行內(nèi)切降解(RNA酶H活性)。 　　AMV反轉(zhuǎn)錄酶和MLV反轉(zhuǎn)錄酶都必須有引物來(lái)起始DNA的合成。三、cDNA第二鏈的合成　　cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種: 　　(1) 自身引導(dǎo)法 合成的單鏈cDNA 339。 　　(2) 置換合成法 該方法利用第一鏈在反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生的cDNA:mRNA雜交鏈不用堿變性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。 (3) 不必使用S1核酸酶來(lái)切割雙鏈cDNA中的單鏈發(fā)夾環(huán)。合成的cDNA也可以經(jīng)PCR擴(kuò)增后再克隆入適當(dāng)載體。二者可使cDNA以粘性末端與載體DNA連接；（3）均聚物加尾法，用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA兩條鏈的3’端各加均聚（A）或均聚（G），載體DNA的3’加配對(duì)的均聚（T）火均聚（C），當(dāng)cDNA末端與載體DNA末端退火后彼此連接，即可用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；（4）將上述幾步合并進(jìn)行，例如，用銜接物喝引物合在一起，合成cDNA后即具有粘性末端，或者將引物加在載體DNA上，cDNA合成直接連在載體上。 　　75%乙醇：用DEPC處理水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。Cl ()，1mmol/L EDTA ()，% SDS?！　⒔M織在液N中磨成粉末后，再以50100mg組織加入1ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過(guò)所用Trizol體積的10%?！　⌒⌒臈壢ド锨逡?，然后室溫或真空干燥510分鐘，注意不要干燥過(guò)分，否則會(huì)降低RNA的溶解度。 　　加氯仿前的勻漿液可在70℃保存一個(gè)月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，20℃保存一年。 　　用1x柱層析加樣緩沖液沖洗柱床。 　　加入1/10體積的3M NaAc()， ， 混勻， 20℃30分鐘。 　　[注意] mRNA在70%乙醇中70℃可保存一年以上。 　　一、材料 　　提純TMV病毒液（10mg/ml）?！　∥∷嘤谝恍耬ppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有機(jī)相交界面無(wú)蛋白為止。　　小心棄去上清液，沉淀真空干燥5分鐘或空氣干燥10分鐘，并溶于無(wú)RNA酶的雙菌水或TE緩沖液中。 第四節(jié) cDNA合成技術(shù) 　　一、 Riboclone MMLV(H ) cDNA合成技術(shù) 　　Promega公司的RibocloneR MMLV(H ) cDNA合成系統(tǒng)采用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H缺失突變株取代AMV反轉(zhuǎn)錄酶,使合成的cDNA更長(zhǎng)。 375mmol/l KCl。Cl ,。 。 　　(3) 37℃(隨機(jī)引物)或42℃(其它引物)溫浴1小時(shí) 　　(4) 取出置于冰上 　　(5) 摻入測(cè)定的eppendorf管加入95μl 50mM EDTA終止反應(yīng),并使總體積為100μl。 　　14℃溫浴2小時(shí)(如需合成長(zhǎng)于3kb的cDNA, 則需延長(zhǎng)至34小時(shí))。 　　加入10μl 200mmol/L EDTA終止反應(yīng)?！　? 小心移去上清液,干燥沉淀。 　　(2) 同樣各取3μl中反應(yīng)液至含有100μl(1mg/ml)鮭魚(yú)精DNA中,混勻, 5% TCA, 渦旋混合儀混合后置冰上530分鐘。 　　4. 第二鏈產(chǎn)量計(jì)算　　除需去除第一鏈摻入dNTP外,方法同第一鏈產(chǎn)量計(jì)算 　　第二鏈摻入率= 摻入放射性活性/ 總放射性活性?? 　　摻入dNTP量(nnol)=[ dNTP/μl反應(yīng)體積(μl)－第一鏈摻入nmol]第二鏈摻入率 　　第二鏈cDNA合成量(ng)=nmol dNTP330ng/nmol 　　雙鏈cDNA轉(zhuǎn)變率=雙鏈cDNA合成量(ng)/ 單鏈cDNA合成量(ng) 　　例: 第二鏈摻入放射性活性強(qiáng)度為2780cmp, 總放射性活性強(qiáng)度為235000cpm. 　　第二鏈摻入率=2780/235000100%=% 　　第二鏈合成dNTP量=[(100μl)－]% = 　　合成第二鏈cDNA量(ng)=330ng/nmol =155ng 　　雙鏈cDNA轉(zhuǎn)變率=155ng /158ng100%=98% 　　一般cDNA第一鏈轉(zhuǎn)變率和雙鏈轉(zhuǎn)變率以1250%和50200%為好。 　　2. 電泳分析 　　(1) 用50mM NaCl, 1mM %的堿性瓊脂糖電泳, 并置堿性電泳緩沖液中30分鐘。 　　(5) 用保鮮膜包裹干燥的膠,室溫壓X光片(用增感屏?xí)r70℃壓片)。50mmol/L 　　MgCl2。 　　50ml 40mM焦碳酸鈉 　　625m rRNasin RNA酶抑制劑 　　600m AMV反轉(zhuǎn)錄酶 　　5mg 　　200ml 10第二鏈緩沖液，配方如下： 　　400mmol/L Tris 30mmol/L DTT。 　?。▽?duì)NotⅠ）和15m/mg. 　　試劑： 　　[a32P]dCTP（400ci/mmol)，EDTA(50mM和200mM)，TE飽和酶/氯仿， NH4Ac，100%和70%乙醇，TE緩沖液(10mM Tris 　?。?）輕彈eppendorf管，取出5ml至另一加于25m[a32P]dCTP c400ci/mmol）（其體積不能超過(guò)1ml），用以第一鏈同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y(cè)定。可取90ml進(jìn)行電泳分析，另10ml進(jìn)行同位素?fù)饺霚y(cè)定。 第五章　重組質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化及篩選第一節(jié) 概 述 　　質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)調(diào)整連接反應(yīng)中外源DNA片段和載體DNA的濃度比例,可以將載體的自身環(huán)化限制在一定程度之下,也可以進(jìn)一步采取一些特殊的克隆策略,如載體去磷酸化等來(lái)最大限度的降低載體的自身環(huán)化,還可以利用遺傳學(xué)手段如α互補(bǔ)現(xiàn)象等來(lái)鑒別重組子和非重組子。 由于質(zhì)粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個(gè)相同粘性末端，因此在連接反應(yīng)中外源片段和質(zhì)粒載體DNA均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個(gè)分子串連形成寡聚物, 而且正反兩種連接方向都可能有。帶539。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)以促進(jìn)DNA分子凝聚成聚集體的物質(zhì)以提高轉(zhuǎn)化效率。由于pBS上帶有Ampr 和lacZ基因,故重組子的篩選采用Amp抗性篩選與α互補(bǔ)現(xiàn)象篩選相結(jié)合的方法。 　　pBS上帶有β半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和β半乳糖苷酶N端146個(gè)氨基酸的編碼序列。但在pBS和DH5α融為一體時(shí)可形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。在麥康凱培養(yǎng)基上，α互補(bǔ)產(chǎn)生的Lac+細(xì)菌由于含β