【正文】 ，即考慮 DNA疫苗是否有免疫毒性作用，機(jī)體是否對疫苗編碼的抗原產(chǎn)生耐受性，或是否導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)，還應(yīng)對疫苗中污染的細(xì)菌蛋白是否誘發(fā)抗體產(chǎn)生進(jìn)行評估； ②遺傳性作用，即質(zhì)粒 DNA是否與宿主基因組的整合問題； ③生殖毒性研究，可采用 PCR方法對經(jīng)質(zhì)粒 DNA疫苗免疫的雄性或雌性動物的性腺 DNA提取物進(jìn)行檢測 ④致腫瘤性研究，如果質(zhì)粒 DNA疫苗構(gòu)建具有與人的基因組同源的 DNA序列，或其載體含有已知的潛在致癌基因序列時，需展開這方面的研究。 ? HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行 DNA免疫 ， 使已經(jīng)建立的對 HBsAg的特異性免疫耐受狀態(tài)被打破 ，使小鼠產(chǎn)生抗 HBsAg的特異性抗體 。其研究方向符合兒童計劃免疫“一種疫苗預(yù)防多種疾病”的目標(biāo)，具有廣泛的應(yīng)用前景。 關(guān)于自身免疫性疾病的研究 ? 潛在性誘導(dǎo)抗質(zhì)粒 DNA的免疫反應(yīng)是另一個必須關(guān)注的安全性問題。 尚無證據(jù)證明以自身表達(dá)質(zhì)粒的形式存在于染色體外的外源 DNA能整合入宿主染色體中 。 多肽合成疫苗的核酸推導(dǎo)序列作用核酸疫苗的候選基因 從病原體亞單位成分中篩選保護(hù)性抗原及編碼基因 3． 1 免疫篩選法 3． 2 化學(xué)分解法 候選基因的篩選原則 Ligate PCR product into pTARGETTM Vector Transform TG1 cells Selecte rebinant clones by ampicillin pstⅠ 酶切鑒定 挑取 S基因正向插入的重組質(zhì)粒 pTARGEThanS測序 重組質(zhì)粒 pTARGEThanS的構(gòu)建 : 引物 1:CT ACT ATG GCA ACT ATG GAG GAA 引物 2:AC TAA TTA GAG TTT CAA AGG CTC PCR 正向 : 酶切成 3674， 1870， 1470 反向 : 可酶切成 3674， 2600,740 可 酶 切 成 和 EcoRⅠ 酶切 瓊脂糖凝膠電泳 回收 對照空載體 pTARGET的構(gòu)建： 用連接酶連接 成為閉環(huán) pTARGET空載體 ,作為對照載體備用 。 ? 病毒感染性疾病的核酸疫苗 ? 非病毒微生物感染性疾病的核酸疫苗 ? 寄生蟲核酸疫苗 ? 腫瘤核酸疫苗 發(fā)展前景 核酸疫苗的研究只是近十幾年發(fā)展起來的一項新的生物技術(shù)，它已成為疫苗研究領(lǐng)域中的熱點之一，特別是其研究方向與世界衛(wèi)生組織兒童疫苗計劃的長遠(yuǎn)目標(biāo)（用一種疫苗預(yù)防多種疾?。┫辔呛稀Ｒ驗樗鼈兛梢詫⒒蛞呙缰苯映仕徒o APCs ，所以這種方法運送效率高、免疫方法簡單、免疫效果好，能同時激活粘膜免疫和全身免疫，并可獲得對載體菌的免疫等優(yōu)點。下面通過對基因疫苗經(jīng)過肌肉組織和黏膜免疫的抗原呈遞途徑來說明基因疫苗的工作原理。此時轉(zhuǎn)化混合物中的 DNA形成抗 DNase的羥基 鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，經(jīng)短暫的熱激（ 42 ℃ ）處理后，外源基因容易進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。 、 、 （ +/）、 pcDNA pcDNA4/HisMAX、 pBudCE pRc/RSV 、 pRc/CMV2等多種 基因疫苗的構(gòu)建 二、基因疫苗的構(gòu)建方法 獲得需要的目的基因常用的方法： （ 1）直接從生物體中提取總 DNA，構(gòu)建基因組 DNA文庫 (genomic DNA library)，從中調(diào)用目的基因； （ 2）以 mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的DNA片段，建立 cDNA文庫； （ 3）利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR）特異性地擴(kuò)增所需要的目的基因片段，等等。主題：基因疫苗和核酸疫苗戰(zhàn)略。 ? 1991年 Williams等發(fā)現(xiàn)外源基因輸入體內(nèi)的表達(dá)產(chǎn)物可誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。核酸疫苗 LOGO Diagram 4 核酸疫苗定義 1 2 3 5 核酸疫苗的發(fā)展史 核酸疫苗的作用原理 核酸疫苗的構(gòu)建 核酸疫苗的優(yōu)缺點和應(yīng)用現(xiàn)狀 疫苗 是將病原微生物（如細(xì)菌、立克次氏體、病毒等）及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預(yù)防傳染病的自動免疫制劑。 ? 1990年 wolff等從事于基因治療工作時，用外源性重組質(zhì)粒給小鼠肌肉注射后，質(zhì)粒被攝取并能在體內(nèi)至少兩個月穩(wěn)定地表達(dá)所編碼蛋白。 ? 1995年 2月 1617日，美國馬里蘭州，Bethesda（ NIH）。 按照載體功能可分為克隆載體和表達(dá)載體； 按照載體來源可分為質(zhì)粒、噬菌體、黏粒和病毒載體等。其原理是細(xì)菌處于 0℃ 、低滲CaCl2溶液中時，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜通透性增加。 由于這個過程實際上是相當(dāng)復(fù)雜的，所以人們對一些具體的細(xì)節(jié)并不清楚。 （ 2）用重組減毒胞內(nèi)菌系統(tǒng) 采用志賀氏菌、沙門氏菌或李斯特菌等重組減毒胞內(nèi)菌系統(tǒng)，通過粘膜自然感染途徑運送 DNA 疫苗是一類很好的方法。人們期望用核酸疫苗來征服諸如微生物感染性疾病、寄生蟲病等頑癥，并用于腫瘤、遺傳病和其他多種疾病的基因水平治療，所以作了多方面的嘗試。 Immune mechanisms induced by inoculation with naked DNA Depiction of the mechanisms of generation of antigenspecific humoural and cellular responses. 五 、 核酸疫苗的構(gòu)建 將亞單位疫苗的編碼基因作為核酸疫苗的候選基因 。 有關(guān)基因整合的研究 一個最重要的理論危機(jī)是質(zhì)粒 DNA與宿主基因組整合的問題，因為當(dāng)外源 DNA與基因組整合后，可能因插入活性癌基因、或活化宿主原癌基因、或使抑癌基因失活，或引起染色體斷裂，或染色體重排而致染色體不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞形成。 實驗結(jié)果 ： 結(jié)論 ：免疫耐受與抗原類型、濃度、給藥方式及宿主種屬、宿主年齡等因素有關(guān)。