[基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)]核酸疫苗及免疫研究進(jìn)展-文庫(kù)吧資料
2025-02-28 00:53本頁(yè)面
【正文】 3． 2 化學(xué)分解法 候選基因的篩選原則 Ligate PCR product into pTARGETTM Vector Transform TG1 cells Selecte rebinant clones by ampicillin pstⅠ 酶切鑒定 挑取 S基因正向插入的重組質(zhì)粒 pTARGEThanS測(cè)序 重組質(zhì)粒 pTARGEThanS的構(gòu)建 : 引物 1:CT ACT ATG GCA ACT ATG GAG GAA 引物 2:AC TAA TTA GAG TTT CAA AGG CTC PCR 正向 : 酶切成 3674， 1870， 1470 反向 : 可酶切成 3674， 2600,740 可 酶 切 成 和 EcoRⅠ 酶切 瓊脂糖凝膠電泳 回收 對(duì)照空載體 pTARGET的構(gòu)建： 用連接酶連接 成為閉環(huán) pTARGET空載體 ,作為對(duì)照載體備用 。 四 、 核酸疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng) 核酸疫苗誘導(dǎo)的全身免疫應(yīng)答反應(yīng) 關(guān)于核酸疫苗誘導(dǎo)全身免疫應(yīng)答反應(yīng)的機(jī)制目前了解的還不十分清楚 ， 但其誘導(dǎo)過(guò)程可大致分為以下幾個(gè)階段： ① 疫苗的攝取 、 轉(zhuǎn)運(yùn)及表達(dá)； ② 抗原的加工和提呈； ③ 淋巴細(xì)胞的活化； ④ 免疫效應(yīng)細(xì)胞和分子的作用 。 核酸疫苗研究 進(jìn)展 一、概 述 核酸疫苗又稱(chēng)基因疫苗或 DNA疫苗，就是把外源基因克隆到真核質(zhì)粒表達(dá)載體上，然后將重組的質(zhì)?；蛑苯用庖邫C(jī)體 ，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫反應(yīng)。它的研究具有深遠(yuǎn)意義，可用于細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)等多種疾病的防治，其多價(jià)、高效、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)使其潛在的應(yīng)用價(jià)值不可估量。 ? 病毒感染性疾病的核酸疫苗 ? 非病毒微生物感染性疾病的核酸疫苗 ? 寄生蟲(chóng)核酸疫苗 ? 腫瘤核酸疫苗 發(fā)展前景 核酸疫苗的研究只是近十幾年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的生物技術(shù)，它已成為疫苗研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)之一，特別是其研究方向與世界衛(wèi)生組織兒童疫苗計(jì)劃的長(zhǎng)遠(yuǎn)目標(biāo)（用一種疫苗預(yù)防多種疾病）相吻合。 核酸疫苗的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： 1 免疫保護(hù)力增強(qiáng) 2 制備簡(jiǎn)單，省時(shí)省力 3 同種異株交叉保護(hù) 4 應(yīng)用較安全 5 產(chǎn)生持久免疫應(yīng)答 6 貯存、運(yùn)輸方便 7 可用于防治腫瘤 缺點(diǎn)： 1 質(zhì)粒 DNA可能誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng) 2 持續(xù)表達(dá)外源抗原可能產(chǎn)生一些不良后果 3 肌肉注射質(zhì)粒后，僅有很少部分被肌細(xì)胞所攝取 4 影響核酸疫苗誘發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答的因素很多 ５外源 DNA注入體內(nèi)后，可能整合到宿主基因組上，使宿主細(xì)胞抑癌基因失活或癌基因活化，使宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化成癌細(xì)胞 核酸疫苗的應(yīng)用現(xiàn)狀 ? 有關(guān)質(zhì)粒 DNA疫苗在人類(lèi)及動(dòng)物產(chǎn)生預(yù)防和治療作用的研究報(bào)道不斷增加，應(yīng)用范圍也逐漸擴(kuò)大。接著激活特異的 CTL ，裂解表達(dá)抗原的 APCs ， APCs 內(nèi)的抗原被釋放激活輔助 T 細(xì)胞和誘導(dǎo)抗體反應(yīng)，激活細(xì)胞免疫和體液免疫。 攜帶基因疫苗重組減毒沙門(mén)氏菌誘發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答的機(jī)制 重組減毒沙門(mén)氏菌攜帶的基因疫苗激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫的機(jī)制還不完全清楚 。因?yàn)樗鼈兛梢詫⒒蛞呙缰苯映仕徒o APCs ，所以這種方法運(yùn)送效率高、免疫方法簡(jiǎn)單、免疫效果好，能同時(shí)激活粘膜免疫和全身免疫，并可獲得對(duì)載體菌的免疫等優(yōu)點(diǎn)。基因疫苗經(jīng)過(guò)黏膜免疫可以很好地激活 B細(xì)胞分泌 IgA，同時(shí)啟動(dòng) Th2細(xì)胞功能，但其對(duì)細(xì)胞免疫（尤其是 CTL細(xì)胞）活化不足，通過(guò)黏膜免疫獲得的保護(hù)作用不如通過(guò)肌肉免疫獲得的強(qiáng)烈。 （ 1）直接免疫 旅美中國(guó)科學(xué)家范泓然用皮膚涂抹法給小鼠接種乙肝疫苗取得成功，且檢測(cè)其效果可以和所用的肌肉注射相媲美。 而且在免疫動(dòng)物時(shí)比較方便，尤其是大面積預(yù)防時(shí)，所以關(guān)于基因疫苗通過(guò)皮膚或黏膜免疫激活機(jī)體免疫反應(yīng)機(jī)制的研究也比較活躍。下面通過(guò)對(duì)基因疫苗經(jīng)過(guò)肌肉組織和黏膜免疫的抗原呈遞途徑來(lái)說(shuō)明基因疫苗的工作原理。 （ 2）核酸水平的檢測(cè)： RNA印跡； RTPCR檢測(cè)。 （ 3） DNA序列測(cè)定：末端終止法測(cè)序；自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序 基因疫苗的構(gòu)建 三、重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)與檢測(cè) 磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法、脂質(zhì)體介導(dǎo)等方法都可以用來(lái)將外源質(zhì)粒導(dǎo)入真核細(xì)胞，其中脂質(zhì)體介導(dǎo)容易成功，是最常用的方法。 基因疫苗的構(gòu)建 一般重組質(zhì)粒鑒定主要按照表型篩選、酶切鑒定和測(cè)序鑒定的順序進(jìn)行 （ 1）插入片段鑒定：酶切鑒定； PCR鑒定。此時(shí)轉(zhuǎn)化混合物中的 DNA形成抗 DNase的羥基 鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，經(jīng)短暫的熱激（ 42 ℃ ）處理后，外源基因容易進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。 感受態(tài)：細(xì)菌經(jīng)過(guò) CaCl2溶液處理和短暫熱激后，容易攝入外源 DNA，這種狀態(tài)稱(chēng)為感受態(tài)。 粘性末端連接 用同一種或兩種 限制性內(nèi)切酶 酶切 DNA連接酶 重組質(zhì)粒 質(zhì)粒 目的基因 本法適用于在質(zhì)粒和目的基 因上有 相同 單或雙酶切位點(diǎn) 平末端連接 質(zhì)粒 產(chǎn)生 平末端 的 內(nèi)切酶 DNA連接酶 核酸酶 S1 目的基因 重組質(zhì)粒 本法適用于在質(zhì)粒 和目的基因上 沒(méi)有 相同 的酶切位點(diǎn)！ 基因疫苗的構(gòu)建 轉(zhuǎn)化：將質(zhì)粒或者以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入 細(xì)菌 的過(guò)程。 連接的方式可分為 粘性末端連接 和 平末端連接 兩種，其中前者連接效率較高，使用比較多。 、 、 （ +/）、 pcDNA pcDNA4/HisMAX、 pBudCE pRc/RSV 、 pRc/CMV2
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