【正文】 0,96h)。利用溶液顏色的差異進(jìn)行比色測(cè)定，適合于蛋白質(zhì)類的定量分析，尤其適合于稀有蛋白質(zhì)的微量分析。 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 17 表 31 考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線 考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線 試管編號(hào) 0 1 2 3 4 5 6 mg/mL 牛血清蛋白 蒸餾水 考馬斯亮藍(lán) 將 10 個(gè) 100 mL 三角燒瓶分別加入經(jīng)稀釋后的藻液。 實(shí)驗(yàn) 特點(diǎn) 高效液相色譜法有 “ 四高一廣 ” 的特點(diǎn)： （ 1） 高壓：流動(dòng)相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對(duì) 載液 加高壓。編號(hào)為 1～ 3 的 3 瓶藻樣作為控制樣參照，不添加抗生素；標(biāo)號(hào)為 4～ 6 的，控制四環(huán)素濃度為 1 mg/L；標(biāo)號(hào)為 7～ 9 的，控制四環(huán)素濃度為 2 mg/L；標(biāo)號(hào)為 10～ 12 的，控制四環(huán)素濃度為 5 mg/L；標(biāo)號(hào)為 13～ 15 的，控制四環(huán)素濃度為 10 mg/L。 在 Excel 中線性擬合 后得到數(shù)據(jù)具有顯著地線性相關(guān)性。 圖 41 吸光度和銅綠微囊藻細(xì)胞個(gè)數(shù)的線性關(guān)系 易得 680 nm 波長(zhǎng)下，銅綠微囊藻細(xì)胞的吸光度和藻細(xì)胞個(gè)數(shù)的線性關(guān)系為： 2212 .78 4 , 9Y x R? ? ? （ 41） 生長(zhǎng)曲線與抑制率 基于以上實(shí)驗(yàn)，我在進(jìn)行四環(huán)素對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的實(shí)驗(yàn)上，將藻細(xì)胞接種初始時(shí)刻的吸光度值控制為 Abs，即相當(dāng)于 106個(gè) /mL。 測(cè)定銅綠微囊藻藻液中四環(huán)素含量前，首先配置、測(cè)定并繪制四環(huán)素液相的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 （ 3） 高效：分離效能高。標(biāo)號(hào)為 3 和 4 的，控制四環(huán)素濃度為 1 mg/L；標(biāo)號(hào)為 5～ 7 的，控制四環(huán)素濃度為 5 mg/L；標(biāo)號(hào)為 8～ 10 的，控制四環(huán)素濃度為 10 mg/L。 試劑配制 染色液：取考馬斯亮藍(lán) G250 100 mg 溶于 50 mL 85%磷酸，加水稀釋至一升。編號(hào)為 0～ 3 的 4 瓶藻樣作為控制樣參照，不添加抗生素；標(biāo)號(hào)為 4～ 6 的，控制四環(huán)素濃度為 1 mg/L；標(biāo)號(hào)為 7～ 9 的，控制四環(huán)素濃度為 2 mg/L；標(biāo)號(hào)為 10～ 12 的，控制四環(huán)素濃度為 5 mg/L；標(biāo)號(hào)為 13～ 15 的，控制四環(huán)素濃度為 10 mg/L。 銅綠微囊藻生物量的測(cè)定： 通過顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行藻類計(jì)數(shù)和在波長(zhǎng) 680nm下測(cè)定藻類光密度，建立不同藻類細(xì)胞密度和光密度之間線性關(guān)系，以計(jì)數(shù)的藻細(xì)胞濃度和光密度表示藻生物量，通過二者線性關(guān)系進(jìn)行檢驗(yàn)。 銅綠微囊藻細(xì)胞數(shù)與吸光度的關(guān)系 實(shí)驗(yàn)原理 我們采用微生物的 光學(xué)顯微鏡 直接計(jì)數(shù)法。四環(huán) 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 13 素類抗生素能夠抑制水生動(dòng)物多種酶的活性，如乙氧基試鹵靈 O去乙基酶、β 半乳糖苷酶等，并可能造成魚類較嚴(yán)重的 DNA 損傷。三角燒瓶應(yīng)用 四層紗布封口以防污染 和傾倒 ， 培養(yǎng)前藻液應(yīng)當(dāng)為淺綠色，經(jīng)過 7 天的培養(yǎng)，藻液顏色變化為翠綠色。等到需要用時(shí)方才取出 。 配置后均需超聲溶解并混合均勻。4H2O g/L 93 硫酸鋅 ZnSO4 以上實(shí)驗(yàn)藥品均為上海展云化工有限公司的分析純藥品。2H2O、 C6H8O7藻類生長(zhǎng)因子包括光照、二氧化碳、適宜的溫度、 pH值及氮、磷、微量元素等其他營(yíng)養(yǎng)成分，這些因子的變化會(huì)刺激或抑制藻類的生長(zhǎng)。二次供水的污染情況要大于管網(wǎng)水，重慶涪陵區(qū)城鄉(xiāng)用水的二次供水中檢測(cè)出 MC 最大濃度為 μg/L（ 20xx 年 9 月）， 10 月份農(nóng)村井水中 MC 平均含量為 μg/L。王紅兵等曾檢測(cè)到上海淀山湖水體中 MC 濃度最高可達(dá) ng/mL。自然界中水華暴發(fā)時(shí)，若無外來影響使其迅速溶解，水體中的毒素含量至多只有 ～ 10 μg/L，而細(xì)胞內(nèi)的毒素則會(huì)高出幾個(gè)數(shù)量級(jí) ［ 26］ 。銅綠微囊藻對(duì)光照度要求不高，較低光照度即可快速增長(zhǎng)，光照度 20xx～ 6000 Lx 適宜銅綠微囊藻快速增殖，在 4000 Lx 時(shí)生長(zhǎng)最快。藍(lán)藻在地球上分布十分廣泛，遍及世界各地，但大多數(shù)（約 75%）淡水產(chǎn)，少數(shù)海產(chǎn)；有些藍(lán)藻可生活在 60～ 85?C 的溫泉中；有些種類和菌、苔蘚、蕨類和裸子植物共生；有些還可穿入鈣質(zhì)巖石或介殼中（如穿鈣藻類）或土壤深層中（如土壤藍(lán)藻）。四環(huán)素對(duì)淋病奈瑟菌具一定抗菌活性，但 耐青霉素 的淋球菌對(duì)四環(huán)素也耐藥。用于治療肺炎、斑疹傷寒、 阿米巴 痢等。 分子式 C20H24N2O8，分子量 。L1（ 95%置信區(qū)間為： ~ mg根的生長(zhǎng)較發(fā)芽對(duì)土霉素更為敏感，土霉素對(duì)紫花苜蓿發(fā)芽及根生長(zhǎng)的抑制率分別達(dá)61%和 85%。 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 4 表 11 抗菌藥對(duì)銅綠微囊藻的急性毒性 抗菌藥對(duì)銅綠微囊藻的急性毒性 藥物 濃度范圍 48hEC50 72hEC50 96hEC50 紅霉素 泰樂菌素 替米考星 泰妙菌素 新霉素 阿米卡星 卡那霉素 —— —— —— 氟苯尼考 恩諾沙星 3 諾氟沙星 —— —— —— 四環(huán)素類抗生素對(duì)植物的生態(tài)毒性 目前四環(huán)素類抗生素對(duì)植物的生態(tài)毒性的研究主要集中在對(duì)實(shí)驗(yàn)室模擬條件下水生植物和陸生植物的水培養(yǎng)條件下的毒性研究。L1（ 95%置信區(qū)間：~ mg Ferreira 等同時(shí)研究了四環(huán)素對(duì)扁藻的和鹵蟲的生長(zhǎng)抑制情況，結(jié)果表明，扁藻對(duì)四環(huán)素的敏感度大約為鹵蟲的 70 倍，這一規(guī)律也被許多類似實(shí)驗(yàn)所驗(yàn)證 ［ 15～ 18］ 。 由此可見，四環(huán)素類抗生素的污染作為一個(gè)全球性普遍存在的問題，這類物質(zhì)一般均具備高生物活性和持久性，這就決定了其必然具有一定的潛在生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)果表明，土霉素在糞肥中的半衰期為 30 d，在糞肥熟化 5 個(gè)月后仍然檢測(cè)到土霉素的殘留，含量達(dá)到 820 μg目前，四環(huán)素類抗生素中最主要種類包括四環(huán)素、土霉素、金霉素等，其他半 合成制取種類主要包括甲烯土霉素、強(qiáng)力霉素、二甲胺基四環(huán)素等。例如，綿羊口服的土霉素中 21%通過尿液排出體外，而 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 2 對(duì)于幼牛 17~75%的氯四環(huán)素未經(jīng)代謝就以母體化合物的形態(tài)被排出體外。濫用抗生素使得抗生素以活性形式存在于污水中?？股啬茉诓煌潭壬掀鸬娇咕?、殺菌和抑菌作用，其作用機(jī)理主要包括：通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的形成，使細(xì)菌因喪失細(xì)胞壁保護(hù)而死亡；影響胞漿膜通透性，使細(xì)菌屏障和運(yùn)輸物質(zhì)功能受到障礙；影響蛋白質(zhì)合成，使細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制；影響核 酸代謝，使細(xì)菌生長(zhǎng)分裂受到抑制等等。 本文同時(shí)通過高效液相色譜法檢測(cè)了四環(huán)素在銅綠微囊藻 液中的降解情況，結(jié)果表明： 該反應(yīng)屬于一級(jí) 動(dòng)力學(xué) 反應(yīng)， Ln（四環(huán)素濃度）與反應(yīng)時(shí)間呈線性關(guān)系。 Smyth, M. R.。 Suzuki, M.。 Tse, K.。 Klumpp, S., Tautomycin from the bacterium Streptomucesverticillatus another potent and specific inhibitor of protein phosphatase1 and phosphatese2A. FEBS Lett. 1990, 277 (12), 137140. 6. Matsushima, R.。 Bartram, J., Toxic Cyanobacteria in Water: a guide to their public health consequences, monitoring and management. E amp。 化合物染毒基本條件具備。 掌握急性毒性實(shí)驗(yàn)方法。藻細(xì)胞用 BG11（ pH=）培養(yǎng)基培養(yǎng)。 三、設(shè)計(jì)的技術(shù)要求（論文的研究要求） 掌握藍(lán)藻培養(yǎng)方法； 掌握藻類急性毒性實(shí)驗(yàn)方法； 掌握蛋白含量測(cè)定方法； 掌握液相檢測(cè)抗生素的方法。 Carmichael, W. W.。 Harada, K.。 Curini, R.。 Oishi, S.。 15～ 16 周： 整理數(shù)據(jù)，論文撰寫。 Microcystis aeruginosa。 抗生素在畜禽生產(chǎn)中的使用就更加令人擔(dān)憂，常以高劑量使用治療各種疾病，以低劑量使用促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)和增產(chǎn)，因此其在畜禽生產(chǎn)中的使用量非常大。 多方面的資料表明，現(xiàn)有水處理技術(shù)對(duì)污水中含有的相當(dāng)一部分抗生素沒有明顯的去除效果如抗癲癇藥卡馬西平的去除率僅為 8%，而降血脂藥氯貝酸的去除率幾乎為 0，全部隨污水處理廠出水進(jìn)入受納水體?？股卦谒a(chǎn)養(yǎng)殖中也被廣泛使用，近年來公布的數(shù)據(jù)表明，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)使用的抗生素僅有 20~30%被魚類吸收， 70~80%進(jìn)入水環(huán)境中。在密集型畜牧養(yǎng)殖場(chǎng)這種現(xiàn)象同樣嚴(yán)重。k1 和 mg因此，對(duì)四環(huán)素類藥物的生態(tài)毒理研究非常必要。通過 96 h 暴露，在四環(huán)素濃度大于 mg強(qiáng)力霉素對(duì)綠藻的毒性為 IC50= mg Migliore 等 ［ 22］ 的研究證實(shí)了該機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)植物的根是抗生素藥物的主要積累場(chǎng)所。同時(shí)，根據(jù)水蚤繁殖測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)過程（ OECD， 1996）利用半靜態(tài)檢驗(yàn)估計(jì)其對(duì)水蚤生殖能力的毒性效應(yīng)。L1），其 NOEC 和 LOEC 值分別為 637 mg微溶于水，溶于 乙醇 和 丙酮 ，在空氣中穩(wěn)定，但易吸收水分，受強(qiáng)日光照射變色?？捎山鹈顾孛撀戎频?，或由培養(yǎng)能產(chǎn)生四環(huán)素 的放線菌的 發(fā)酵液 中提取。四環(huán)素的作用機(jī)制在于藥物能特異性地與細(xì)菌核糖體 30S 亞基的 A 位置結(jié)合，阻止氨基酰－ tRNA 在該位上的聯(lián)結(jié)，從而抑制肽連的增長(zhǎng)和影響細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。細(xì)胞常聚集成肉眼可見的群落，這些群落本為圓形，經(jīng)過時(shí)間發(fā)展可能會(huì)產(chǎn)生孔洞并呈不規(guī)則形狀。藍(lán)藻的毒素是細(xì)胞內(nèi)毒素，當(dāng)細(xì)胞腐敗裂解后，毒素被釋放到水體中。這其中，以云南滇池、江蘇太湖、安徽巢湖 的藍(lán)藻水華污染最為嚴(yán)重。陳剛等在原發(fā)性肝癌高發(fā)地區(qū)江蘇海 門等地的許多溝塘中檢出大量的微囊藻毒素，河水和溝塘水中檢出的 MC最高分別達(dá) 1558 pg/mL 和 300 pg/mL。因此 研究四環(huán)素類抗生素對(duì)銅綠微囊藻的毒性、以及銅綠微囊藻對(duì)四環(huán)素的降解作用， 不僅有助于我們進(jìn)一步了解四環(huán)素類抗生素和銅綠微囊藻的特性，也旨 進(jìn)一步了解并掌握 四環(huán)素的化學(xué)性質(zhì)及生物有效性，化合物的染毒及抗生素殘留分析的方法。 本課題將研究 ： 銅綠微囊藻細(xì)胞 密度 與吸光度的關(guān)系 、 銅綠微囊藻生長(zhǎng)曲線及抑制率 、銅綠微囊藻 pH 變化規(guī)律 、 考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 、 高效液相色譜檢測(cè)四環(huán)素在銅綠微囊藻液中的降解 。4H2O、 ZnSO43H2O g/L 3 硫酸鎂 MgSO45H2O g/L 96 硝酸鈷 Co(NO3)2 本實(shí)驗(yàn)采用 高壓蒸氣滅菌法 。 接種時(shí)須滿足以下條件： 藻種的質(zhì)量一般要求選取無敵害生物污染、生活力強(qiáng)、生長(zhǎng)旺盛的藻種培養(yǎng) ， 藻液的外觀應(yīng)顏色正常、無大量沉淀和無明顯附壁現(xiàn)象 ； 接種的藻液容量和新配培養(yǎng)液量的比例為 1:2～ 1:3； 接種的時(shí)間最好是在上午的 8 時(shí)～ 10 時(shí)，不宜在晚上接種。每天搖動(dòng) 3 次 。項(xiàng)目采用的實(shí)驗(yàn)方法和分析測(cè)試技術(shù)，都是公開報(bào)道經(jīng)過證實(shí)的實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)，能保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性。 計(jì)數(shù)區(qū)邊長(zhǎng)為 1 mm，則計(jì)數(shù)區(qū)的面積為 l mm2，每個(gè)小方格的面積為 1/400 mm2。兩次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)匯總，做出藻樣密度和吸光度之間的關(guān)系曲線，并線性擬合?？捡R斯亮藍(lán) G250 能與蛋白質(zhì)通過范得華相互作用形成蛋白質(zhì) ——考馬斯亮藍(lán)復(fù)合物藍(lán)色溶液，引起該染料的最大吸收 λmax的位置發(fā)生紅移，在 595 nm 處有最大吸收值。 位置濃度的蛋白質(zhì)溶液用酪蛋白配制，濃度控制在 10～ 30 mg/mL 實(shí)驗(yàn)方法 取 7 支試管，按下表加入試劑，將試管搖勻，放置 20 min。 高效液相色譜檢測(cè)四環(huán)素在銅綠微囊藻液中的降解 實(shí)驗(yàn)原理 高效液相層析儀根據(jù)各種各樣的化工互作用力來分離混合物。 （ 5） 應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 18 大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢(shì)。 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 19 測(cè)定銅綠微囊藻藻液中四環(huán)素含量時(shí)，使用一次性無菌 針頭抽取約 1 mL 藻液，經(jīng)濾頭過濾后置于離心管內(nèi)， 進(jìn)樣量為 20 μL。 = 0204060801001200 藻細(xì)胞生物量(105 ) 吸光度 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 21 表 41 銅綠微囊藻藻液吸光度數(shù)據(jù) 銅綠微囊藻液吸光度數(shù)據(jù) NO. c(四 ) 12/25 12/26 12/27 12/28 12/29 12/30 12/31 Abs Abs Av Abs Av Abs Av Abs Av Abs Av Abs Av 0 0 mg/L 1 2 3 4 1 mg/L