【正文】 gattctc tccgagaaaa catccttttt ggatgtcagc tggaggaacc 2401 atattacagg tccgtgatac aggcctgtgc cctcctccca gacctggaaa tcctgcccag 2461 tggggatcgg acagagattg gcgagaaggg cgtgaacctg tctgggggcc agaagcagcg 2521 cgtgagcctg gcccgggccg tgtactccaa cgctgacatt tacctcttcg atgatcccct 2581 ctcagcagtg gatgcccatg tgggaaaaca catctttgaa aatgtgattg gccccaaggg 2641 gatgctgaag aacaagacgc ggatcttggt cacgcacagc atgagctact tgccgcaggt 2701 ggacgtcatc atcgtcatga gtggcggcaa gatctctgag atgggctcct accaggagct 2761 gctggctcga gacggcgcct tcgctgagtt cctgcgtacc tatgccagca cagagcagga 2821 gcaggatgca gaggagaacg gggtcacggg cgtcagcggt ccagggaagg aagcaaagca 2881 aatggagaat ggcatgctgg tgacggacag tgcagggaag caactgcaga gacagctcag 2941 cagctcctcc tcctatagtg gggacatcag caggcaccac aacagcaccg cagaactgca 3001 gaaagctgag gccaagaagg aggagacctg gaagctgatg gaggctgaca aggcgcagac 3061 agggcaggtc aagctttccg tgtactggga ctacatgaag gccatcggac tcttcatctc 3121 cttcctcagc atcttccttt tcatgtgtaa ccatgtgtcc gcgctggctt ccaactattg 3181 gctcagcctc tggactgatg accccatcgt caacgggact caggagcaca cgaaatagtccg 3241 gctgagcgtc tatggagccc tgggcatttc acaagggatc gccgtgtttg gctactcc 3301 ggccgtgtcc atcgggggga tcttggcttc ccgctgtctg cacgtggacc tgctgcacag 3361 catcctgcgg tcacccatga gcttctttga gcggaccccc agtgggaacc tggtgaaccg 3421 cttctccaag gagctggaca cagtggactc catgatcccg gaggtcatca agatgttcat 3481 gggctccctg ttcaacgtca ttggtgcctg catcgttatc ctgctggcca cgcccatcgc 3541 cgccatcatc atcccgcccc ttggcctcat ctacttcttc gtccagaggt tctacgtggc 3601 ttcctcccgg cagctgaagc gcctcgagtc ggtcagccgc tccccggtct attcccattt 3661 caacgagacc ttgctggggg tcagcgtcat tcgagccttc gaggagcagg agcgcttcat 3721 ccaccagagt gacctgaagg tggacgagaa ccagaaggcc tattacccca gcatcgtggc 3781 caacaggtgg ctggccgtgc ggctggagtg tgtgggcaac tgcatcgttc tgtttgctgc 3841 cctgtttgcg gtgatctcca ggcacagcct cagtgctggc ttggtgggcc tctcagtgtc 3901 ttactcattg caggtcacca cgtacttgaa ctggctggtt cggatgtcat ctgaaatgga 3961 aaccaacatc gtggccgtgg agaggctcaa ggagtattca gagactgaga aggaggcgcc 4021 ctggcaaatc caggagacag ctccgcccag cagctggccc caggtgggcc gagtggaatt 4081 ccggaactac tgcctgcgct accgagagga cctggacttc gttctcaggc acatcaatgt 4141 cacgatcaat gggggagaaa aggtcggcat cgtggggcgg acgggagctg ggaagtcgtc 4201 cctgaccctg ggcttatttc ggatcaacga gtctgccgaa ggagagatca tcatcgatgg 齊齊哈爾大學畢業(yè)設計 (論文 ) 15 4261 catcaacatc gccaagatcg gcctgcacga cctccgcttc aagatcacca tcatccccca 4321 ggaccctgtt ttgttttcgg gttccctccg aatgaacctg gacccattca gccagtactc 4381 ggatgaagaa gtctggacgt ccctggagct ggcccacctg aaggacttcg tgtcagccct 4441 tcctgacaag ctagaccatg aatgtgcaga aggcggggag aacctcagtg tcgggcagcg 4501 ccagcttgtg tgcctagccc gggccctgct gaggaagacg aagatccttg tgttggatga 4561 ggccacggca gccgtggacc tggaaacgga cgacctcatc cagtccacca tccggacaca 4621 gttcgaggac tgcaccgtcc tcaccatcgc ccaccggctc aacaccatca tggactacac 4681 aagggtgatc gtcttggaca aaggagaaat ccaggagtac ggcgccccat cggacctcct 4741 gcagcagaga ggtcttttct acagcatggc caaagacgcc ggcttggtgt gagccccaga 4801 gctggcatat ctggtcagaa ctgcagggcc tatatgccag cgcccaggga ggagtcagta 4861 cccctggtaa accaagcctc ccacactgaa accaaaacat aaaaaccaaa cccagacaac 4921 caaaacatat tcaaagcagc agccaccgcc atccggtccc ctgcctggaa ctggctgtga 4981 agacccagga gagacagaga tgcgaaccac c 根據 2 個靶序列設計的 2 對 DNA 干涉片段 mrp11， mrp12 序列見表 ； ： 表 根據靶位點合成的干涉片段 1（ mrp11） 序列 Table siRNA sequence synthesized according to target 1point 1 Mrp1 靶序列 1 aattctcaatgggatcaaagt 正義鏈（ 2sense） 5′GATCCaattctcaatgggatcaaagtTTCAAGAGAactttgatcccattgagaattTTTTTTGGAAA3′ 反義鏈（ 2antisense） 5′AGCTTTTCCAAAAAAaattctcaatgggatcaaagtTCTCTTGAAactttgatcccattgagaattG3′ 表 根據靶位點合成的干涉片段 2（ mrp12） 序列 Table siRNA sequence synthesized according to target 1point 2 Mrp1 靶序列 2 ggatcaagaccgctgtcat 正義鏈（ 3sense） 5′GATCCggatcaagaccgctgtcatTTCAAGAGAatgacagcggtcttgatccTTTTTTGGAAA3′ 反義鏈（ 3antisense） 5′AGCTTTTCCAAAAAAggatcaagaccgctgtcatTCTCTTGAAatgacagcggtcttgatccG3′ 齊齊哈爾大學畢業(yè)設計 (論文 ) 16 合成干涉片段的退火 合成片段的退火體系： 干涉片段 1 干涉片段 2 sense 2 μL 2 μL antisense 2 μL 2 μL 10PCR buffer 5 μL 5 μL dd H2O 41 μL 41 μL 各 管 混勻后 90℃ 保溫 3 分鐘， 37℃ 保溫 1h，再取 5μL 退火溶液加 45μL 滅菌雙蒸水混勻，使干涉片段終濃度為 8ng/μL。 (2)溶液 II： ， 1% SDS。 質粒載體 ，該質粒源自Genscript 公司（ Scotch PlamsUSA） 。 RNA 干擾是近年來發(fā)現(xiàn)的能快速、高效、特異的沉默目的基因表達的技術，如能通過 RNAi 技術沉默 MDR1 基因，逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥性將為改善癌癥病人的化療效果奠定基礎。這一發(fā)現(xiàn)提示可以應用 RNAi 技術來抑制 MRP1基因的蛋白表達。 在最近的研究中顯示特定目的基因的表達可被 RNA 干擾高效抑制 。 MRP 在組織中的表達 典型的 MDR 機制在腫瘤耐藥中起一定作用，但多數學者發(fā)現(xiàn) MDR1 基因和 PgP在 腫瘤 中的表達水平并不高，難以解釋 NSCIC 的高度耐藥。經序列分析，將 MRP1 分為 ATP結合框超家族中的一員， MDR/P糖蛋白也屬于這一超家族。 [20]除此之外， 質粒載體 一般還帶有一些可以進行體外轉錄外源 DNA、鑒定片段的插入方向等用途的 序列。表達載體是指使目的基因在宿主細胞中得以表達的載體。隨著 RNAi 技術的不斷成熟， 腫瘤的研究有了空前 突破 ，研究的重點主要在有關 腫瘤免疫逃逸、 腫瘤性疾病信號傳導的途徑、 癌基因及抑癌基因的敲除、 提高腫瘤對化療及放療的敏感性等方面 [18]。 RNaseIII 核酶家族的 Dicer 是 RNA干擾中 一個非常重要的酶。 一旦啟動子區(qū)域出現(xiàn) 甲基化 ，那么轉錄將被阻斷 ，如 編碼區(qū)出現(xiàn) 甲基化，則 可以 進行 轉錄 ，但在轉錄后水平上沉默。 隨著科學技術的發(fā)展和 RNAi 研究的深入，人們對 RNAi 的作用機制的了解也越來越多，通過生化和遺傳學研究，現(xiàn)在 普遍 認為 RNAi 可能的作用機制主要包括兩個階段：第一步 ： 起始階段，即內源或外源 dsRNA 經特定的 RNase III 家族的雙鏈特異的核糖核酸酶 (Dicer) 以 ATP 依賴的方式將長的 dsRNA 切割成 21～ 23 nt的小干擾 RNA；第二步，效應階段，即 siRNA 與 RNA 誘導沉默復合物 RISC 結合共同降解靶 mRNA[11]。這種情況揭示了 RNAi 現(xiàn)象可能出現(xiàn)于生命進化的早期階段，在 RNAi機制發(fā)現(xiàn)之前，不同生物中的 RNAi 現(xiàn)象有 齊齊哈爾大學畢業(yè)設計 (論文 ) 2 著不同的描述：真菌中稱為 ―鎮(zhèn)壓 ‖作用，在植物中被稱為轉錄后基因沉默和基因協(xié)同抑制 [8]。 Rich Jensan 把這種現(xiàn)象稱為共同抑制，因為導入 了外源性 基因 ，使得 和內源性 基因 具有相似功能的 基因的 表達都被抑制了 [1]。 方法：將預先根據 MRP1 基因序列設計合成的編碼 siRNA 的 cDNA 序列與，構建靶向 mrp1 siRNA 重組質粒。 齊 齊 哈 爾 大 學 畢業(yè)設計（論文） 題 目 靶向 MRP1 基因 粒表達載體 構建 齊齊哈爾大學畢業(yè)設計 (論文 ) I 摘 要 癌癥嚴重威脅著人類的健康，其發(fā)病率呈上升趨勢。將重組質粒轉化 DH5α 后大量提取重組質粒，經菌落 PCR 和 DNA 測序分析檢測重組載體構建結果。遺憾的是當時這種現(xiàn)象并未引起 Jensen 的重視。 RNAi的 分子作用機制 RNAi的作用機制在 眾多學者的 努力 研究 下 日漸明朗 。 除此之外還有某些研究 認為 RNAi的作用機制還存在著第三階段 ——循環(huán)放大階段。 非特異效應 研究表明， 長度大于 30nt 的長雙鏈 RNA 轉染至 哺乳動物 體內 ， dsRNA 會 激活雙鏈RNA 所 依賴的蛋白激酶途徑 [13]， 從而導致 EIF2α 因子磷酸化，進而非特異性地抑制翻譯， 誘發(fā)全面的細胞基因沉默 。它 可以結合到 dsRNA上，并 剪切 其 成 為 21～23nt 且 339。 用于 RNAi 的載體 基因工程中，攜帶目的基因進入宿主細