【正文】 ，構(gòu)建靶向 MRP1 基因 重組質(zhì)粒表達(dá)載體 。 化療作為其常規(guī)臨床治療手段，在癌癥治療中具有手術(shù)和放射治療不能替代的作用。 隨后的研究中發(fā)現(xiàn)， RNAi現(xiàn)象廣泛存在于果蠅， 線蟲(chóng)， 斑馬魚(yú)，真菌以及植物等生物體內(nèi)，這些生物體利用 RNA 干擾 來(lái)抵御病毒的感染，阻斷轉(zhuǎn)座子的作用?；蛑委熓?治療 腫瘤 的新手段 ， 目前共有 3種 MDR基因治療的策略： 將 相關(guān) 凋亡基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，促使其凋亡； 使用反義技術(shù)抑制腫瘤細(xì)胞耐藥基因表達(dá)； 將外源 mdr1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入人造血干細(xì)胞以提高骨髓對(duì)化療藥物的耐藥性。通過(guò)對(duì)基因敲除的動(dòng)物進(jìn)行研究確定了 MRP1 的功能。 質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的 天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，因而不適合用作基因工程的載體，必須對(duì)之進(jìn)行改造構(gòu)建： （ 1）加入合適 的選擇標(biāo)記基因，如兩個(gè)以上，易于用作選擇 （ 2）增加或減少合適的酶切位點(diǎn)，便于重組 （ 3）縮短長(zhǎng)度，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量 （ 4）改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝 （ 5）根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件 MRP1的研究進(jìn)展 在 1992 年多藥耐藥相關(guān)蛋白 1（ MRP1 又被稱為 ABCC1）的識(shí)別以及它的起始特征闡明了這種蛋白確實(shí)代表了一種選擇性藥物泵。質(zhì)粒載體是 為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作 在天然質(zhì)粒的 基礎(chǔ)上人工構(gòu)建的。 載體按其應(yīng)用范圍，可以分為克隆載體和表達(dá)載體。目前 , 影響 siRNA功能的因素包括 siRNA序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，靶 mRNA的空間結(jié)構(gòu) RISC與 siRNA的相互作用，以 及 siRNA與 mRNA錯(cuò)配等 [17]。 除此之外， RNAi 還具有共抑制性、種屬時(shí)效性和 dsRNA 的長(zhǎng)度限制性的特點(diǎn)。 抑制相應(yīng) mRNA 的翻譯可 阻礙 相應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá) ，這就是翻譯水平的 RNA 干擾機(jī)制 [12]，其中 stRNA 起 到了非常的 重要作用 。 其中， RNAi 的特異效應(yīng)作用機(jī)制是在 多個(gè)不同的水平上實(shí)現(xiàn)的，包括 翻譯水平 、 轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平等。 Fire[5]等 將 雙鏈 RNA，即正義 鏈和反義鏈的混合物，注射到 線蟲(chóng) 的體內(nèi) ， 卻 誘發(fā)了比 正義鏈或反義鏈的 單獨(dú)注射 效果更強(qiáng) 的基因沉默， 要 徹底使 同源基因的表達(dá) 沉默 ， 在 每 一 個(gè)細(xì)胞 中 ， 只需要 很少 的 幾個(gè)分子的雙鏈 就可以做到。 RNAi 有望成為分析人類基因組功能的有力工具，在腫瘤病因、免疫機(jī)制及治療等方面的研究上有廣闊的發(fā)展前景。 RNA 干擾 (RNA interference， RNAi)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的能快速、高效、特異的沉默目的基因表達(dá)的技術(shù)，如能通過(guò) RNAi 技術(shù)沉默 MDR1 基因，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性將為改善癌癥病人的化療效果奠定基礎(chǔ)。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥的原因較為復(fù)雜，多藥耐藥相關(guān)蛋白 1（ Multidrug Resistanceassociated Protein 1， MRP1）的過(guò)度表達(dá)是導(dǎo)致其產(chǎn)生多藥耐藥的主要原因之一。 關(guān)鍵詞 ： RNA 干擾； MRP1； ；穿梭載體 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) II Abstract Cancer, a serious threat to human health, the incidence are on the rising trend. Chemotherapy as the routine clinical therapy of tumor, which is an irreplaceable way in cancer treatment. MDR of tumor cell cause the failure of chemotherapy treatment . The reason causing the cancer MDR is relatively plicated, and the excessively expression of multidrug resistanceassociated protein 1(MRP1) is one of the reasons causing MDR. Silencing MDR1 gene by RNAi, we can improve the effect of chemotherapy by decrease the level of MDR. Objective: In this study, RNAi expression vector of mrp1 mRNA. Methods: According to mrp1 we designed and synthesized the DNA fragment that was cloned into rebinant vector into DH5α. The result of rebinant vector was analyzed and identified using PCR and DNA sequencing . Results: Constructing was constructed successfully. It may be the foundation of restrain the expression of MRP1 gene in cancer cells. Key Words： RNA interference； MRP1； ； shuttle vector 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) III 目 錄 摘 要 .................................................................... I Abstract ................................................................... II 第 1章 緒 論 .............................................................. 1 RNAi 的研究進(jìn)展 .................................................... 1 RNAi 的發(fā)現(xiàn)過(guò)程 .............................................. 1 RNAi 的分子作用機(jī)制 .......................................... 2 RNAi 的特點(diǎn) .................................................. 3 siRNA 簡(jiǎn)介 ................................................... 3 siRNA 的設(shè)計(jì)原則 ............................................. 3 RNAi 在抗腫瘤方面的研究 ...................................... 4 用于 RNAi 的載體 ................................................... 4 載體的選擇 ................................................... 5 質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的 ........................................... 5 MRP1 的研究進(jìn)展 ................................................... 5 MRP 的轉(zhuǎn)運(yùn)底物、組織分布及生理作用 ........................... 6 MRP 在組織中的表達(dá) ........................................... 6 基因治療 ........................................................... 7 本課題在國(guó)內(nèi)外的研究現(xiàn)狀 ........................................... 7 本論文的研究目的及意義 ............................................. 8 本論文的主要內(nèi)容 ................................................... 8 第 2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法 ..................................................... 9 實(shí)驗(yàn)材料 ........................................................... 9 宿主菌 ....................................................... 9 質(zhì)粒載體 ..................................................... 9 載體通用引物 ................................................ 11 主要試劑及工具酶 ............................................ 11 主要儀器 .................................................... 12 實(shí)驗(yàn)方法 .......................................................... 13 shRNA 的設(shè)計(jì)與退火 .......................................... 13 合成干涉片段的退火 .......................................... 16 重組載體的構(gòu)建 .............................................. 17 菌落 PCR 初步篩選陽(yáng)性重組子 .................................. 20 測(cè)序鑒定重組載體 ............................................ 21 重組質(zhì)粒大提的 OD 值檢測(cè) ..................................... 21 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) IV 第 3章 結(jié)果與分析 ........................................................ 22 質(zhì)粒經(jīng) HindⅢ 和 BamHI 雙酶切后膠回收結(jié)果 .......................... 22 質(zhì)粒經(jīng) HindⅢ和 BamHI 雙酶切后結(jié)果 ........................... 22 目的片段的回收 .............................................. 23 重組載體的菌落 PCR ............................................... 24 重組質(zhì)粒大量提取 .................................................. 25 重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果 .................................................. 26 討 論 .................................................................... 29 菌落 PCR 鑒定重組 ................................................. 29 重組質(zhì)粒穿梭載體的構(gòu)建 ............................................ 29 結(jié) 論 .................................................................... 30 參考文獻(xiàn) ................................................................. 31 致 謝 ................................................................... 34 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 1 第 1章 緒 論 RNAi 的研究進(jìn)展 RNA 干擾 (RNA interference , RNAi)是由雙鏈 RNA 分子介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因 沉默 過(guò)程，為 一種 雙鏈 RNA 分子在 mRNA 水平上關(guān)閉相關(guān)基因表達(dá)的過(guò)程，是一項(xiàng)新興的基因阻斷技術(shù)。直到 1998 年，關(guān)于 RNAi 現(xiàn)象的研究才被人們真正的發(fā)現(xiàn) [4]。 [9]。這種 dsR