【正文】 Ai, we can improve the effect of chemotherapy by decrease the level of MDR. Objective: In this study, RNAi expression vector of mrp1 mRNA. Methods: According to mrp1 we designed and synthesized the DNA fragment that was cloned into rebinant vector into DH5α. The result of rebinant vector was analyzed and identified using PCR and DNA sequencing . Results: Constructing was constructed successfully. It may be the foundation of restrain the expression of MRP1 gene in cancer cells. Key Words： RNA interference； MRP1； ； shuttle vector 齊齊哈爾大學畢業(yè)設計 (論文 ) III 目 錄 摘 要 .................................................................... I Abstract ................................................................... II 第 1章 緒 論 .............................................................. 1 RNAi 的研究進展 .................................................... 1 RNAi 的發(fā)現(xiàn)過程 .............................................. 1 RNAi 的分子作用機制 .......................................... 2 RNAi 的特點 .................................................. 3 siRNA 簡介 ................................................... 3 siRNA 的設計原則 ............................................. 3 RNAi 在抗腫瘤方面的研究 ...................................... 4 用于 RNAi 的載體 ................................................... 4 載體的選擇 ................................................... 5 質(zhì)粒人工構建的目的 ........................................... 5 MRP1 的研究進展 ................................................... 5 MRP 的轉(zhuǎn)運底物、組織分布及生理作用 ........................... 6 MRP 在組織中的表達 ........................................... 6 基因治療 ........................................................... 7 本課題在國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀 ........................................... 7 本論文的研究目的及意義 ............................................. 8 本論文的主要內(nèi)容 ................................................... 8 第 2章 實驗材料與方法 ..................................................... 9 實驗材料 ........................................................... 9 宿主菌 ....................................................... 9 質(zhì)粒載體 ..................................................... 9 載體通用引物 ................................................ 11 主要試劑及工具酶 ............................................ 11 主要儀器 .................................................... 12 實驗方法 .......................................................... 13 shRNA 的設計與退火 .......................................... 13 合成干涉片段的退火 .......................................... 16 重組載體的構建 .............................................. 17 菌落 PCR 初步篩選陽性重組子 .................................. 20 測序鑒定重組載體 ............................................ 21 重組質(zhì)粒大提的 OD 值檢測 ..................................... 21 齊齊哈爾大學畢業(yè)設計 (論文 ) IV 第 3章 結果與分析 ........................................................ 22 質(zhì)粒經(jīng) HindⅢ 和 BamHI 雙酶切后膠回收結果 .......................... 22 質(zhì)粒經(jīng) HindⅢ和 BamHI 雙酶切后結果 ........................... 22 目的片段的回收 .............................................. 23 重組載體的菌落 PCR ............................................... 24 重組質(zhì)粒大量提取 .................................................. 25 重組質(zhì)粒測序結果 .................................................. 26 討 論 .................................................................... 29 菌落 PCR 鑒定重組 ................................................. 29 重組質(zhì)粒穿梭載體的構建 ............................................ 29 結 論 .................................................................... 30 參考文獻 ................................................................. 31 致 謝 ................................................................... 34 齊齊哈爾大學畢業(yè)設計 (論文 ) 1 第 1章 緒 論 RNAi 的研究進展 RNA 干擾 (RNA interference , RNAi)是由雙鏈 RNA 分子介導的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因 沉默 過程，為 一種 雙鏈 RNA 分子在 mRNA 水平上關閉相關基因表達的過程，是一項新興的基因阻斷技術。 方法：將預先根據(jù) MRP1 基因序列設計合成的編碼 siRNA 的 cDNA 序列與，構建靶向 mrp1 siRNA 重組質(zhì)粒。腫瘤細胞產(chǎn)生多藥耐藥的原因較為復雜，多藥耐藥相關蛋白 1（ Multidrug Resistanceassociated Protein 1， MRP1）的過度表達是導致其產(chǎn)生多藥耐藥的主要原因之一。 齊 齊 哈 爾 大 學 畢業(yè)設計（論文） 題 目 靶向 MRP1 基因 粒表達載體 構建 齊齊哈爾大學畢業(yè)設計 (論文 ) I 摘 要 癌癥嚴重威脅著人類的健康，其發(fā)病率呈上升趨勢。 RNA 干擾 (RNA interference， RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)的能快速、高效、特異的沉默目的基因表達的技術，如能通過 RNAi 技術沉默 MDR1 基因，逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥性將為改善癌癥病人的化療效果奠定基礎。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DH5α 后大量提取重組質(zhì)粒，經(jīng)菌落 PCR 和 DNA 測序分析檢測重組載體構建結果。 RNAi 有望成為分析人類基因組功能的有力工具，在腫瘤病因、免疫機制及治療等方面的研究上有廣闊的發(fā)展前景。遺憾的是當時這種現(xiàn)象并未引起 Jensen 的重視。 Fire[5]等 將 雙鏈 RNA，即正義 鏈和反義鏈的混合物，注射到 線蟲 的體內(nèi) ， 卻 誘發(fā)了比 正義鏈或反義鏈的 單獨注射 效果更強 的基因沉默， 要 徹底使 同源基因的表達 沉默 ， 在 每 一 個細胞 中 ， 只需要 很少 的 幾個分子的雙鏈 就可以做到。 RNAi的 分子作用機制 RNAi的作用機制在 眾多學者的 努力 研究 下 日漸明朗 。 其中， RNAi 的特異效應作用機制是在 多個不同的水平上實現(xiàn)的，包括 翻譯水平 、 轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平等。 除此之外還有某些研究 認為 RNAi的作用機制還存在著第三階段 ——循環(huán)放大階段。 抑制相應 mRNA 的翻譯可 阻礙 相應的蛋白質(zhì)表達 ，這就是翻譯水平的 RNA 干擾機制 [12]，其中 stRNA 起 到了非常的 重要作用 。 非特異效應 研究表明， 長度大于 30nt 的長雙鏈 RNA 轉(zhuǎn)染至 哺乳動物 體內(nèi) ， dsRNA 會 激活雙鏈RNA 所 依賴的蛋白激酶途徑 [13]， 從而導致 EIF2α 因子磷酸化，進而非特異性地抑制翻譯， 誘發(fā)全面的細胞基因沉默 。 除此之外， RNAi 還具有共抑制性、種屬時效性和 dsRNA 的長度限制性的特點。它 可以結合到 dsRNA上，并 剪切 其 成 為 21～23nt 且 339。目前 , 影響 siRNA功能的因素包括 siRNA序列的結構特點，靶 mRNA的空間結構 RISC與 siRNA的相互作用，以 及 siRNA與 mRNA錯配等 [17]。 用于 RNAi 的載體 基因工程中，攜帶目的基因進入宿主細胞進行擴增和表達的工具，稱為載體。 載體按其應用范圍，可以分為克隆載體和表達載體?？蓪⒅亟M體 DNA 導入適合的受體細胞，使所載的目的基因能夠復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。質(zhì)粒載體是 為適應實驗室操作 在天然質(zhì)粒的 基礎上人工構建的。 [21] 細菌質(zhì)粒是獨立于細菌染色體的自主復制的環(huán)狀雙鏈 DNA 分子，只有酵母的殺傷質(zhì)粒已知是 RNA 分子。 質(zhì)粒人工構建的目的 天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，因而不適合用作基因工程的載體，必須對之進行改造構建： （ 1）加入合適 的選擇標記基因，如兩個以上，易于用作選擇 （ 2）增加或減少合適的酶切位點，便于重組 （ 3）縮短長度，切去不必要的片段，提高導入效率，增加裝載量 （ 4）改變復制子，變嚴緊為松弛，變少拷貝為多拷貝 （ 5）根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件 MRP1的研究進展 在 1992 年多藥耐藥相關蛋白 1（ MRP1 又被稱為 ABCC1）的識別以及它的起始特征闡明了這種蛋白確實代表了一種選擇性藥物泵。 MRP1是一個膜整合糖磷蛋白，其表觀分子量為 190kDa[23,24]，一個運用 ATP 結合 /水解 [25,26]產(chǎn)生的能量，來行使此蛋白主要的有活性的轉(zhuǎn)運功能。通過對基因敲除的動物進行研究確定了 MRP1 的功能。 Narasaki 等發(fā)現(xiàn)許多癌組織同時表達 MRP1 和 MDR1，但后者表達較低，故認為 MRP 1 較 MDR1 能是