【正文】 Ai, we can improve the effect of chemotherapy by decrease the level of MDR. Objective: In this study, RNAi expression vector of mrp1 mRNA. Methods: According to mrp1 we designed and synthesized the DNA fragment that was cloned into rebinant vector into DH5α. The result of rebinant vector was analyzed and identified using PCR and DNA sequencing . Results: Constructing was constructed successfully. It may be the foundation of restrain the expression of MRP1 gene in cancer cells. Key Words： RNA interference； MRP1； ； shuttle vector 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) III 目 錄 摘 要 .................................................................... I Abstract ................................................................... II 第 1章 緒 論 .............................................................. 1 RNAi 的研究進(jìn)展 .................................................... 1 RNAi 的發(fā)現(xiàn)過程 .............................................. 1 RNAi 的分子作用機(jī)制 .......................................... 2 RNAi 的特點(diǎn) .................................................. 3 siRNA 簡介 ................................................... 3 siRNA 的設(shè)計(jì)原則 ............................................. 3 RNAi 在抗腫瘤方面的研究 ...................................... 4 用于 RNAi 的載體 ................................................... 4 載體的選擇 ................................................... 5 質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的 ........................................... 5 MRP1 的研究進(jìn)展 ................................................... 5 MRP 的轉(zhuǎn)運(yùn)底物、組織分布及生理作用 ........................... 6 MRP 在組織中的表達(dá) ........................................... 6 基因治療 ........................................................... 7 本課題在國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀 ........................................... 7 本論文的研究目的及意義 ............................................. 8 本論文的主要內(nèi)容 ................................................... 8 第 2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法 ..................................................... 9 實(shí)驗(yàn)材料 ........................................................... 9 宿主菌 ....................................................... 9 質(zhì)粒載體 ..................................................... 9 載體通用引物 ................................................ 11 主要試劑及工具酶 ............................................ 11 主要儀器 .................................................... 12 實(shí)驗(yàn)方法 .......................................................... 13 shRNA 的設(shè)計(jì)與退火 .......................................... 13 合成干涉片段的退火 .......................................... 16 重組載體的構(gòu)建 .............................................. 17 菌落 PCR 初步篩選陽性重組子 .................................. 20 測序鑒定重組載體 ............................................ 21 重組質(zhì)粒大提的 OD 值檢測 ..................................... 21 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) IV 第 3章 結(jié)果與分析 ........................................................ 22 質(zhì)粒經(jīng) HindⅢ 和 BamHI 雙酶切后膠回收結(jié)果 .......................... 22 質(zhì)粒經(jīng) HindⅢ和 BamHI 雙酶切后結(jié)果 ........................... 22 目的片段的回收 .............................................. 23 重組載體的菌落 PCR ............................................... 24 重組質(zhì)粒大量提取 .................................................. 25 重組質(zhì)粒測序結(jié)果 .................................................. 26 討 論 .................................................................... 29 菌落 PCR 鑒定重組 ................................................. 29 重組質(zhì)粒穿梭載體的構(gòu)建 ............................................ 29 結(jié) 論 .................................................................... 30 參考文獻(xiàn) ................................................................. 31 致 謝 ................................................................... 34 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 1 第 1章 緒 論 RNAi 的研究進(jìn)展 RNA 干擾 (RNA interference , RNAi)是由雙鏈 RNA 分子介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因 沉默 過程，為 一種 雙鏈 RNA 分子在 mRNA 水平上關(guān)閉相關(guān)基因表達(dá)的過程，是一項(xiàng)新興的基因阻斷技術(shù)。 方法：將預(yù)先根據(jù) MRP1 基因序列設(shè)計(jì)合成的編碼 siRNA 的 cDNA 序列與，構(gòu)建靶向 mrp1 siRNA 重組質(zhì)粒。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥的原因較為復(fù)雜，多藥耐藥相關(guān)蛋白 1（ Multidrug Resistanceassociated Protein 1， MRP1）的過度表達(dá)是導(dǎo)致其產(chǎn)生多藥耐藥的主要原因之一。 齊 齊 哈 爾 大 學(xué) 畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 題 目 靶向 MRP1 基因 粒表達(dá)載體 構(gòu)建 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) I 摘 要 癌癥嚴(yán)重威脅著人類的健康，其發(fā)病率呈上升趨勢。 RNA 干擾 (RNA interference， RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)的能快速、高效、特異的沉默目的基因表達(dá)的技術(shù)，如能通過 RNAi 技術(shù)沉默 MDR1 基因，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性將為改善癌癥病人的化療效果奠定基礎(chǔ)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DH5α 后大量提取重組質(zhì)粒，經(jīng)菌落 PCR 和 DNA 測序分析檢測重組載體構(gòu)建結(jié)果。 RNAi 有望成為分析人類基因組功能的有力工具，在腫瘤病因、免疫機(jī)制及治療等方面的研究上有廣闊的發(fā)展前景。遺憾的是當(dāng)時這種現(xiàn)象并未引起 Jensen 的重視。 Fire[5]等 將 雙鏈 RNA，即正義 鏈和反義鏈的混合物，注射到 線蟲 的體內(nèi) ， 卻 誘發(fā)了比 正義鏈或反義鏈的 單獨(dú)注射 效果更強(qiáng) 的基因沉默， 要 徹底使 同源基因的表達(dá) 沉默 ， 在 每 一 個細(xì)胞 中 ， 只需要 很少 的 幾個分子的雙鏈 就可以做到。 RNAi的 分子作用機(jī)制 RNAi的作用機(jī)制在 眾多學(xué)者的 努力 研究 下 日漸明朗 。 其中， RNAi 的特異效應(yīng)作用機(jī)制是在 多個不同的水平上實(shí)現(xiàn)的，包括 翻譯水平 、 轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平等。 除此之外還有某些研究 認(rèn)為 RNAi的作用機(jī)制還存在著第三階段 ——循環(huán)放大階段。 抑制相應(yīng) mRNA 的翻譯可 阻礙 相應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá) ，這就是翻譯水平的 RNA 干擾機(jī)制 [12]，其中 stRNA 起 到了非常的 重要作用 。 非特異效應(yīng) 研究表明， 長度大于 30nt 的長雙鏈 RNA 轉(zhuǎn)染至 哺乳動物 體內(nèi) ， dsRNA 會 激活雙鏈RNA 所 依賴的蛋白激酶途徑 [13]， 從而導(dǎo)致 EIF2α 因子磷酸化，進(jìn)而非特異性地抑制翻譯， 誘發(fā)全面的細(xì)胞基因沉默 。 除此之外， RNAi 還具有共抑制性、種屬時效性和 dsRNA 的長度限制性的特點(diǎn)。它 可以結(jié)合到 dsRNA上，并 剪切 其 成 為 21～23nt 且 339。目前 , 影響 siRNA功能的因素包括 siRNA序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，靶 mRNA的空間結(jié)構(gòu) RISC與 siRNA的相互作用，以 及 siRNA與 mRNA錯配等 [17]。 用于 RNAi 的載體 基因工程中，攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具，稱為載體。 載體按其應(yīng)用范圍，可以分為克隆載體和表達(dá)載體。可將重組體 DNA 導(dǎo)入適合的受體細(xì)胞，使所載的目的基因能夠復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。質(zhì)粒載體是 為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作 在天然質(zhì)粒的 基礎(chǔ)上人工構(gòu)建的。 [21] 細(xì)菌質(zhì)粒是獨(dú)立于細(xì)菌染色體的自主復(fù)制的環(huán)狀雙鏈 DNA 分子，只有酵母的殺傷質(zhì)粒已知是 RNA 分子。 質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的 天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，因而不適合用作基因工程的載體，必須對之進(jìn)行改造構(gòu)建： （ 1）加入合適 的選擇標(biāo)記基因，如兩個以上，易于用作選擇 （ 2）增加或減少合適的酶切位點(diǎn)，便于重組 （ 3）縮短長度，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量 （ 4）改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝 （ 5）根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件 MRP1的研究進(jìn)展 在 1992 年多藥耐藥相關(guān)蛋白 1（ MRP1 又被稱為 ABCC1）的識別以及它的起始特征闡明了這種蛋白確實(shí)代表了一種選擇性藥物泵。 MRP1是一個膜整合糖磷蛋白，其表觀分子量為 190kDa[23,24]，一個運(yùn)用 ATP 結(jié)合 /水解 [25,26]產(chǎn)生的能量，來行使此蛋白主要的有活性的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。通過對基因敲除的動物進(jìn)行研究確定了 MRP1 的功能。 Narasaki 等發(fā)現(xiàn)許多癌組織同時表達(dá) MRP1 和 MDR1，但后者表達(dá)較低，故認(rèn)為 MRP 1 較 MDR1 能是