【正文】 kb marker ； 2. ； 和 BamHI 雙酶切； 4. HindIII 單酶切 圖 33 雙酶切 DNA ladder 。混勻后取 100μL 涂布于含 Amp的篩選平板上，正面向上放置 30 分鐘，待菌液完全被培養(yǎng)基吸 收后倒置培養(yǎng)皿， 37℃培養(yǎng) 1624h（培養(yǎng)箱中）。 （ 7） 4℃ 離心 10min（ 4000r/min）。 注：以下分別將四組干擾片段構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)記為 、 。 （ 2） 50℃ 水溶 510 分鐘，膠完全溶化即可，其間可振蕩助溶 23 次，待溶化后將溶液置于 吸附柱 中， 8000g/分 離心 30s，若一次加不完，可分 多 次離心。l無 菌水溶解沉淀。l RNaseA， 37℃ ，水浴 30min。 （ 9）加 15ml 水再加 15ml LiCl（預(yù)冷）混勻，靜置沉淀 15min， 4℃ 下 10000r/min離心 15min，以出去蛋白質(zhì)和 RNA。 （ 4）用 17ml 溶液 Ⅰ 吹散重懸 細(xì)菌沉淀物，加 3ml新配制的溶菌酶溶液，溫和混勻，室溫放置 10min，裂解大腸桿菌。其退火過程見圖 22： 圖 22 干涉片段的退火 Figure 22 Anneal of DNA fragment 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 17 重組載體的構(gòu)建 （ 1） 將含有 （含 2μg/mL 氨芐青霉素）的 500mL 三角瓶中，置 37℃ 振蕩培養(yǎng)過夜（置搖床中160r/min）。 (4)溶菌酶（現(xiàn)用現(xiàn)配）：取 溶菌酶溶 于 10mL 10mmol/L TrisHCl（ ）。 質(zhì)粒圖譜 見圖 21 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 10 p R N A T H 1 . 1 / S h u t t l e R F P6 1 6 8 bpA m p c i l l i n ( 4 7 4 6 5 6 0 6 )N e o m y c i n ( 2 4 5 0 3 2 4 4 )P 1 S c e 1 ( 1 8 0 2 )P o l y A ( 1 3 5 1 )R F P (6 4 1 1 3 3 6 )S V 4 0 P ro m o t e r (2 0 6 4 2 4 0 9 )H 1 p r o m o t e r ( 6 0 4 3 6 1 4 2 )C M V P ro m o t e r ( 3 7 6 2 4 )p U C o ri ( 3 9 5 8 4 5 9 8 )B a m H I ( 61 4 4 )H in d I I I (6 1 6 2 )K p n I (6 1 6 0 ) 圖 21 Detailed map of 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 11 載體通用引物 正向引物（ M13）： 5′GTTTTCCCAGTCACGAC3′ 反向引物（ Rev）： 5′ GAGTTAGCTCACTCATTAGGC 3′ 主要試劑及工具酶 質(zhì)粒快速提取試劑盒 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限司 Sanprep 柱式 DNA 膠回收試劑盒 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限司 10PCR buffer 北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司 dNTP 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限司 Marker(1kb,100bp) 上海生工生物工程技服務(wù)有限公司 Goldview DNA 染料 北京賽百盛基因技術(shù)有限公司 吖啶橙 北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司 氨芐青霉素 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限司 EDTA Bio Basic Inc 溶菌酶 北京鼎國生物技術(shù)有 限責(zé)任公司 LiCl Amresco RNase Sigma bactotyptone Bio Basic Inc bactoyeast extract Bio Basic Inc PEG8000 北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司 TriS 飽和酚 北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司 HindⅢ NEB 公司 BamHI NEB 公司 T4DNA 連接酶 NEB 公司 Taq 酶 北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司 電泳緩沖液及培養(yǎng)基 50TAE 電泳緩沖液： Tris 堿 242g，冰乙酸 ， EDTA（ Na2EDTA 本論文的主要內(nèi)容 依據(jù)研究的目的及實(shí)驗(yàn)思路，本論文主要內(nèi)容包括 1． 根據(jù)腫瘤細(xì)胞的 mrp1 基因核苷酸序列，按照靶位點(diǎn)的尋找原則，設(shè)計(jì)并合成 2個(gè)編碼 shRNA 的 DNA 模板 shmrp11 和 shmrp12。 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 8 由于 RNAi 技術(shù)的高效性和高度特異性， RNAi 已成為頗為理想的細(xì)胞水平基因敲除工具，并迅速成為后基因組時(shí)代功能基因組學(xué)研究中不可或缺的重要手段，并為基因治療開辟了新的途徑。 RNAi 的 作為 一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的技術(shù)手段， 正逐步被應(yīng)用于遺傳性疾病、病毒性疾病 以及腫瘤等的基因治療 。在 腫瘤 復(fù)雜的耐藥機(jī)制中 ， MRP1 和 MRP3 的過度表達(dá) 發(fā)揮 了 重要作用。 MRP 的轉(zhuǎn)運(yùn)底物、組織分布及生理作用 MRP1 的底物 直接通過細(xì)胞毒性分析和底物刺激的 ATP 酶測(cè)量進(jìn)行識(shí)別 MRP1 的底物的，底物是由大量的多樣化的疏水復(fù)合物，有 機(jī)陰離子結(jié)合物以及陰離子非結(jié)合性底物所組成。 環(huán)狀 雙鏈 DNA 分子有三種構(gòu)型。 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 5 質(zhì)粒是 為一種 1200kb 不等的雙鏈、閉環(huán)的 DNA 分子。是指能夠運(yùn)載外源 DNA 片段（目的基因）進(jìn)入受體細(xì)胞，具有自我復(fù)制能力，使外源 DNA片段在受體細(xì)胞中得到擴(kuò)增和表達(dá)，不被受體細(xì)胞的酶系統(tǒng)所破壞的一類 DNA 分子。端突出的小分子 RNA 片斷，形成 siRNA。 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 3 RNAi的 特點(diǎn) RNAi 具有高效性，也就是說與細(xì)胞內(nèi)的 mRNA 的量相比，注入細(xì)胞內(nèi)的 siRNA的量要少得多。這是 RNAi 的 自身循環(huán)放大機(jī)制，其機(jī)制 主要是指在效應(yīng)階段， RISC活化后與 mRNA 結(jié)合， mRNA 被內(nèi)切核酸酶 切割 成大小在 l2～ 23nt 不等 的 小 片段， 這些片段可以特異性地阻礙表達(dá)靶基因 。 不同生物 體內(nèi)的 RNA 干擾 作用機(jī)制 也 各有不同， 但是 主要 可以 分為兩種 類型 ： 特異效應(yīng)作用機(jī)制與 非 特異效應(yīng)作用機(jī)制 。 1994 年， Cogoni[2]和 Macino 采用粗糙脈胞霉進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究時(shí)，發(fā)現(xiàn) 真菌中也存在 類似 的 現(xiàn)象，他們稱之為基因 抑制 ，這一現(xiàn)象后來在其它真菌中也相繼被發(fā)現(xiàn)。 結(jié)果：成功構(gòu)建靶向 MRP1 基因 。 化療作為其常規(guī)臨床治療手段，在癌癥治療中具有手術(shù)和放射治療不能替代的作用。構(gòu)建針對(duì) mrp1 mRNA的 RNA 干擾表達(dá)載體。他們嘗試把 pigmentproduing 這種由 強(qiáng)有力 的 啟動(dòng)子控制的基因?qū)氚珷颗；ㄒ约由罨ǖ淖仙?，結(jié)果 卻發(fā)現(xiàn) 不但顏色未加深，許多花呈現(xiàn)雜色甚至白色。 隨后， RNAi 現(xiàn)象又陸續(xù)在果蠅、錐形蟲、真菌、渦蟲、植物及斑馬魚等真核生物的研究中被發(fā)現(xiàn) [7]。 [10] 特異性效應(yīng) 轉(zhuǎn)錄后水平的 RNA 干擾的發(fā)生 機(jī)制是在對(duì) 果蠅 、 線蟲 等生物體進(jìn)行 科學(xué) 研究 從 而進(jìn)一步推導(dǎo)得出來的。有 文獻(xiàn)談到組蛋白 H3 及相應(yīng) DNA 區(qū)域可被 dsRNA 誘導(dǎo)甲基化。通過對(duì)植物的研究證明，雙鏈 RNA 復(fù)合體 降解 為 35nt 左右的小 RNA 分子后 通過序列互補(bǔ)與 mRNA 結(jié)合， 進(jìn)而降解 mRNA。 RNAi 具有特異性、簡(jiǎn)易性及高效性的特點(diǎn)， 可 穩(wěn)定沉默 突變基因，而 對(duì) 正常基因的表達(dá) 不產(chǎn)生影響 ，在腫瘤的研究及治療上有著 無法比擬 的優(yōu)勢(shì)。一般具有較低的分子量、較高的拷貝數(shù)和松弛型復(fù)制子。但是，天然質(zhì)粒的缺點(diǎn)是分子量大，拷貝數(shù)低，所以 為使分子量盡可能減少 ，必須去掉 大部分 的 非必需序列，以便于基因工程操作。 MRP1 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 6 基因 (ABCC1)位于染色體 上并且編碼含有 1531 個(gè)氨基酸的蛋白。但是幾次嘗試證實(shí) MRP1 在 體內(nèi)的保護(hù)作用都沒有成功。 RNAi 是一種用 dsRNA 作為序列特異性的觸發(fā)器指導(dǎo)同源單鏈 RNA 降解的細(xì)胞機(jī)制。 [29]自 20xx 年 5 月以后，先后出現(xiàn)將RNAi 技術(shù)應(yīng)用于抑制艾滋病病毒、丙型肝炎病毒（如美國科學(xué)家 Mc Caffrey）和癌細(xì)胞（如我國徐根興教授）的研究報(bào)道。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥的原因較為復(fù)雜，多藥耐藥相關(guān)蛋白1 的過度表達(dá)是導(dǎo)致其產(chǎn)生多藥耐藥的主要原因之一。 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 9 第 2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法 實(shí)驗(yàn)材料 宿主菌 DH5α：為感受態(tài)宿主菌由北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。 大提質(zhì)粒溶液配置 (1)溶液 I： 50mmol/L C6H12O6， 25mmol/L TrisHCl（ ）， 10mmol/L EDTA（ ）。 shRNA的 DNA 模板由上海生工合成，單鏈干涉片段退火后形成雙鏈。 （ 3）加預(yù)冷的溶液 Ⅰ 50ml 于每離心桶，混勻，洗滌沉淀。 （ 7）將上清液在 4℃ 下以 10000r/min 離心 10min，然后將上清液經(jīng) 8 層紗布過濾至新離心桶中，以盡量除去蛋 白質(zhì)。 （ 12）用 70%乙醇洗滌沉淀， 4℃ 下以 10000r/min 離心 5min，棄去乙醇，離心桶敞口倒置于紙巾上，使乙醇揮發(fā)殆盡。質(zhì)粒 DNA 溶解于酚相中，中層為蛋白質(zhì)，下層為氯仿 /異戊醇。 （ 3） Wash Solution： 12ml，使用前加入 48ml無水 乙醇，充分混勻。 （ 7）加入 15～ 40μL Elution Buffer（ 60℃ 水浴 Elution Buffer 可提高得率 ），靜置 2分鐘。 （ 4） 4℃ 離心 10min（ 4000r/min）。 轉(zhuǎn)化體系如下： 名稱 所加物質(zhì) 標(biāo)記 實(shí)驗(yàn)組 1 （ 5μL） A 實(shí)驗(yàn)組 2 （ 5μL） B 空白對(duì)照 水（ 1μL） C 陽性對(duì) 照 原質(zhì)粒（ 1μL） D 陰性對(duì)照 DH5α（ 1μL） E 自連對(duì)照 雙酶切后的質(zhì)粒（ 1μL） F （ 3） 各組 放置 冰上 30 分鐘 ， 42℃ 水浴中熱擊 90s， 迅速置于冰上冷卻 2min。將經(jīng)鑒定后未發(fā)生突變的 、 靶向 MRP1 基因 siRNA 重組質(zhì)粒的宿主菌搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)后，進(jìn)行質(zhì)粒大量提取 ,方法如 所述。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 圖 35 重組質(zhì)粒菌落 PCR 電泳圖 100bp marker； 2均為單菌落 PCR 產(chǎn)物 ,其中 2,5 為陽性產(chǎn)物 bacterial colony PCR screening 500bp 600bp pppppp 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 25 重組質(zhì)粒大量提取 重組質(zhì)粒大量提取后的電泳結(jié)果見圖 36，結(jié)果顯。劃板的平皿于 37℃培養(yǎng) 1216h。 [32] 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞 DH5α （ 1） 從冰箱中取出一管 （分裝 6 管，每管 100μL） 感受態(tài)細(xì)胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上。 (此時(shí)， A600 應(yīng)在 之間，細(xì)胞數(shù)務(wù)必＜ 108/mL，此為實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。 （ 5） 空吸附柱 9000g/分再次離心 1 分鐘，甩干剩余液體以除去殘余酒精。 酶切產(chǎn)物的回收純化 酶切產(chǎn)物分別經(jīng) 1%的 TAE 瓊脂糖凝膠分離后，用 DNA 快速純化回收試劑盒回收純化，按照說明書操作： 試劑盒成分： （ 1） 純化套件（吸附柱 +收集管） ： 50 套 （柱上含有樹脂） 。 （ 15）沉淀用 3ml70%乙醇重懸 清洗，以除去 PEG， 120xxr/min 離心 8min。 （ 11）棄上清，得到沉淀的核酸。 （ 6）加 30ml 預(yù)冷的溶液 Ⅲ ，緩慢顛倒數(shù)次，防止 SDS 破壞基因組 DNA，冰浴放置 15min，使蛋白質(zhì)沉淀出來。取出菌懸液，觀察菌體生長(zhǎng)狀況，將菌懸液分裝于兩個(gè) 250ml離心桶中，調(diào)平。 (7) TE（ ）緩沖液： 1mol/L TrisHCl（ ） 500μL， mol/L EDTA（ ） 100μL，加水至 50mL。 LB 液體培養(yǎng)基：將 bactotyptone 2g、 bactoyeast extract 1g 和 NaCl 2g，溶于 195mL 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 12 雙蒸 H2O，溶解后用 5MNaOH 調(diào) PH 值至 ，定容至 200ml，共配置 5 份， 121℃ 濕熱滅菌 30min。 4． 載體 與設(shè)計(jì)合成的 干涉 片段連接