【正文】 區(qū)域可被 dsRNA 誘導(dǎo)甲基化。同時(shí)，釋放出來 一種可以作為特殊引物 的 siRNA，從而以靶 mRNA 為模板 在 RdRP 的 作用下， 合成 新的 dsRNA。 [10] 特異性效應(yīng) 轉(zhuǎn)錄后水平的 RNA 干擾的發(fā)生 機(jī)制是在對(duì) 果蠅 、 線蟲 等生物體進(jìn)行 科學(xué) 研究 從 而進(jìn)一步推導(dǎo)得出來的。特異性效應(yīng)一般發(fā)生在短雙鏈 RNA（ 21～ 23nt）上，非特異性效應(yīng)發(fā)生于 長(zhǎng)雙鏈RNA（ 30nt 以上） 。 隨后， RNAi 現(xiàn)象又陸續(xù)在果蠅、錐形蟲、真菌、渦蟲、植物及斑馬魚等真核生物的研究中被發(fā)現(xiàn) [7]。 1995 年 Guo[3] 等在對(duì)線蟲的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，正義 RNA 與反義 RNA 一樣可以阻斷 par21 基因的表達(dá)， 可惜作者 同樣對(duì)這一現(xiàn)象也沒有 更深入的研究，只做了 普通 的報(bào)道。他們嘗試把 pigmentproduing 這種由 強(qiáng)有力 的 啟動(dòng)子控制的基因?qū)氚珷颗；ㄒ约由罨ǖ淖仙?，結(jié)果 卻發(fā)現(xiàn) 不但顏色未加深，許多花呈現(xiàn)雜色甚至白色。為下一步抑制 mrp1 基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)奠定基礎(chǔ)。構(gòu)建針對(duì) mrp1 mRNA的 RNA 干擾表達(dá)載體。腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性（ multidrug resistance, MDR）是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞化療失敗的主要原因。 化療作為其常規(guī)臨床治療手段，在癌癥治療中具有手術(shù)和放射治療不能替代的作用。 目的：本課題選用 。 結(jié)果：成功構(gòu)建靶向 MRP1 基因 。 RNAi的 發(fā)現(xiàn) 過程 1990 年， Rich Jensan 和他的同事在 對(duì)矮牽?；ㄟM(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，無意中 發(fā)現(xiàn)一種奇怪的現(xiàn)象。 1994 年， Cogoni[2]和 Macino 采用粗糙脈胞霉進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究時(shí)，發(fā)現(xiàn) 真菌中也存在 類似 的 現(xiàn)象，他們稱之為基因 抑制 ，這一現(xiàn)象后來在其它真菌中也相繼被發(fā)現(xiàn)。在接下來進(jìn)行的 實(shí)驗(yàn) 中還證實(shí) [6]，將 雙鏈 RNA 注入線蟲體內(nèi)后 ，不但阻斷 了 線蟲體內(nèi) 所有同源基因的表達(dá)， 同時(shí)還沉默了 其第 1 代子代的同源基因 ，他們 從此把 這種現(xiàn)象命名為 RNAi。 不同生物 體內(nèi)的 RNA 干擾 作用機(jī)制 也 各有不同， 但是 主要 可以 分為兩種 類型 ： 特異效應(yīng)作用機(jī)制與 非 特異效應(yīng)作用機(jī)制 。其中 ， 轉(zhuǎn)錄后水平 RNA 干擾的研究最為深入， 應(yīng)用 也 最為廣泛。這是 RNAi 的 自身循環(huán)放大機(jī)制，其機(jī)制 主要是指在效應(yīng)階段， RISC活化后與 mRNA 結(jié)合， mRNA 被內(nèi)切核酸酶 切割 成大小在 l2～ 23nt 不等 的 小 片段， 這些片段可以特異性地阻礙表達(dá)靶基因 。 轉(zhuǎn)錄水平上的 RNA 機(jī)制 是通過 siRNA 與互補(bǔ)的 DNA 直接發(fā)生作用， 從而加強(qiáng) 同源 DNA 的 甲基化， 以阻礙目的基因轉(zhuǎn)錄 ， 使表達(dá)關(guān)閉，從而強(qiáng)化 基因沉默。 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 3 RNAi的 特點(diǎn) RNAi 具有高效性，也就是說與細(xì)胞內(nèi)的 mRNA 的量相比，注入細(xì)胞內(nèi)的 siRNA的量要少得多。 siRNA簡(jiǎn)介 RNA 干擾作用是通過 siRNA（ small interfering RNA， siRNA）這類小 RNA 分子作為較穩(wěn)定的中間介質(zhì)實(shí)現(xiàn)的 。端突出的小分子 RNA 片斷，形成 siRNA。 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 4 RNAi在抗腫瘤方面的研究 目前對(duì) 腫瘤 的治療手段主要 有 藥物化學(xué)治療、 手術(shù)切除 和 放射治療，這些治療方法均 無法做到特異性地殺傷及完全根除腫瘤，而且副作用較大 。是指能夠運(yùn)載外源 DNA 片段（目的基因）進(jìn)入受體細(xì)胞，具有自我復(fù)制能力，使外源 DNA片段在受體細(xì)胞中得到擴(kuò)增和表達(dá)，不被受體細(xì)胞的酶系統(tǒng)所破壞的一類 DNA 分子。克隆載體是指用于在受體細(xì)胞中進(jìn)行目的基因擴(kuò)增的載體。 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 5 質(zhì)粒是 為一種 1200kb 不等的雙鏈、閉環(huán)的 DNA 分子。 構(gòu)建的質(zhì)粒載體 與天然質(zhì)粒相比通常帶有 一個(gè)或一個(gè)以上的選擇性標(biāo)記基因 (如抗生素抗性基因 )，同時(shí)可能帶有多個(gè)人工合成的單一限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。 環(huán)狀 雙鏈 DNA 分子有三種構(gòu)型。編碼 MRP1 的 cDNA 第一次克隆是通過從阿霉素 選擇性的多藥耐藥人 腫瘤 細(xì)胞系（ H69R）中篩選差異 cDNA 得到的 1。 MRP 的轉(zhuǎn)運(yùn)底物、組織分布及生理作用 MRP1 的底物 直接通過細(xì)胞毒性分析和底物刺激的 ATP 酶測(cè)量進(jìn)行識(shí)別 MRP1 的底物的，底物是由大量的多樣化的疏水復(fù)合物，有 機(jī)陰離子結(jié)合物以及陰離子非結(jié)合性底物所組成。盡管很多體外實(shí)驗(yàn)明確的證實(shí)了：MRP1 介導(dǎo)外源和內(nèi)源物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。在 腫瘤 復(fù)雜的耐藥機(jī)制中 ， MRP1 和 MRP3 的過度表達(dá) 發(fā)揮 了 重要作用。 本課題在國內(nèi)外的研究現(xiàn) 狀 多藥耐藥蛋白基因 1 編碼的多藥耐藥蛋白的過度表達(dá)是重要的 腫瘤 耐藥機(jī)制之一。 RNAi 的 作為 一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的技術(shù)手段， 正逐步被應(yīng)用于遺傳性疾病、病毒性疾病 以及腫瘤等的基因治療 。近幾年來 RNAi 的研究 取得了很大進(jìn)展 ,20xx 年它被《 Science》雜志評(píng)為十大科學(xué)成就之一 ,20xx 年被評(píng)為十大科學(xué)成就之首。 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 8 由于 RNAi 技術(shù)的高效性和高度特異性， RNAi 已成為頗為理想的細(xì)胞水平基因敲除工具，并迅速成為后基因組時(shí)代功能基因組學(xué)研究中不可或缺的重要手段，并為基因治療開辟了新的途徑。腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞化療失敗的主要原因。 本論文的主要內(nèi)容 依據(jù)研究的目的及實(shí)驗(yàn)思路，本論文主要內(nèi)容包括 1． 根據(jù)腫瘤細(xì)胞的 mrp1 基因核苷酸序列，按照靶位點(diǎn)的尋找原則，設(shè)計(jì)并合成 2個(gè)編碼 shRNA 的 DNA 模板 shmrp11 和 shmrp12。 5．用 已 構(gòu)建的靶向 mrp1 基因 桿菌 DH5α 進(jìn)行菌落 PCR，檢測(cè)重組質(zhì)粒構(gòu)建是否正確 ；重組質(zhì)粒大量提取，進(jìn)行 OD 值檢測(cè)。 質(zhì)粒圖譜 見圖 21 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 10 p R N A T H 1 . 1 / S h u t t l e R F P6 1 6 8 bpA m p c i l l i n ( 4 7 4 6 5 6 0 6 )N e o m y c i n ( 2 4 5 0 3 2 4 4 )P 1 S c e 1 ( 1 8 0 2 )P o l y A ( 1 3 5 1 )R F P (6 4 1 1 3 3 6 )S V 4 0 P ro m o t e r (2 0 6 4 2 4 0 9 )H 1 p r o m o t e r ( 6 0 4 3 6 1 4 2 )C M V P ro m o t e r ( 3 7 6 2 4 )p U C o ri ( 3 9 5 8 4 5 9 8 )B a m H I ( 61 4 4 )H in d I I I (6 1 6 2 )K p n I (6 1 6 0 ) 圖 21 Detailed map of 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 11 載體通用引物 正向引物（ M13）： 5′GTTTTCCCAGTCACGAC3′ 反向引物（ Rev）： 5′ GAGTTAGCTCACTCATTAGGC 3′ 主要試劑及工具酶 質(zhì)粒快速提取試劑盒 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限司 Sanprep 柱式 DNA 膠回收試劑盒 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限司 10PCR buffer 北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司 dNTP 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限司 Marker(1kb,100bp) 上海生工生物工程技服務(wù)有限公司 Goldview DNA 染料 北京賽百盛基因技術(shù)有限公司 吖啶橙 北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司 氨芐青霉素 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限司 EDTA Bio Basic Inc 溶菌酶 北京鼎國生物技術(shù)有 限責(zé)任公司 LiCl Amresco RNase Sigma bactotyptone Bio Basic Inc bactoyeast extract Bio Basic Inc PEG8000 北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司 TriS 飽和酚 北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司 HindⅢ NEB 公司 BamHI NEB 公司 T4DNA 連接酶 NEB 公司 Taq 酶 北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司 電泳緩沖液及培養(yǎng)基 50TAE 電泳緩沖液： Tris 堿 242g，冰乙酸 ， EDTA（ Na2EDTA 固體選擇培養(yǎng)基（ Ampr）：每 100ml LB 液體 培養(yǎng)基中加 瓊脂粉， 121℃ 濕熱滅菌 20min，待溫度降至 60℃ 加入終濃度為 50μg/mL 的氨芐青霉素，混勻后倒平板， 4℃保存?zhèn)溆谩? (4)溶菌酶（現(xiàn)用現(xiàn)配）：取 溶菌酶溶 于 10mL 10mmol/L TrisHCl（ ）。 主要儀器 微量振蕩器（ MM2 型） 上海像華化工有限公司 微量振蕩器（ MM2 型） 上海像華化工有限公司 恒溫空氣搖床 北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司 電子天平 北京賽多利斯天平有限公司 紫外分析儀（ ZF 型） 上海康華生化儀器制造廠 低溫離心機(jī)（ SK18） SIGMA 公司 低溫離心機(jī)（ SK18） SIGMA 公司 PCR 儀（ 9600 型） ABI 恒溫磁力攪拌器（ 20xx16） 常州國華電器有限公司 恒溫水浴鍋 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠 自動(dòng)雙重純水儀 上海博通儀器廠 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 13 實(shí)驗(yàn)方法 shRNA的設(shè)計(jì)與退火 根據(jù) siRNA 設(shè)計(jì)原則 [34]，根 據(jù) MRP1 靶序列，設(shè)計(jì)合成四對(duì)互補(bǔ)反向重復(fù)脫氧核糖核酸序列，中間間隔 9nt 莖環(huán)序列 (TTCAAGAGA)， 5′端帶有 BamHⅠ 酶切位點(diǎn)， 3′端帶有 HindⅢ 酶切位點(diǎn)，用 BLAST 進(jìn)行同源性分析，確定與其他基因無同源性。其退火過程見圖 22： 圖 22 干涉片段的退火 Figure 22 Anneal of DNA fragment 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 17 重組載體的構(gòu)建 （ 1） 將含有 （含 2μg/mL 氨芐青霉素）的 500mL 三角瓶中，置 37℃ 振蕩培養(yǎng)過夜（置搖床中160r/min）。預(yù)冷離心機(jī)至 4℃ ，4℃ 下 8000r/min 離心 5min，棄上清，得菌體。 （ 4）用 17ml 溶液 Ⅰ 吹散重懸 細(xì)菌沉淀物，加 3ml新配制的溶菌酶溶液，溫和混勻，室溫放置 10min，裂解大腸桿菌。 4℃ 下以 10000r/min 離心 10min，然后將上清液全部倒入新離心桶中。 （ 9）加 15ml 水再加 15ml LiCl（預(yù)冷）混勻，靜置沉淀 15min， 4℃ 下 10000r/min離心 15min，以出去蛋白質(zhì)和 RNA。敞開瓶口倒 置于紙巾上使殘余上清液流盡。l RNaseA， 37℃ ，水浴 30min。 （ 16）重復(fù)上步操作，將離心管倒扣于紙巾上 10min，使乙醇揮發(fā)干凈，加 1ml H2O溶解，用等體積酚 /氯仿 /異戊醇再抽提一次蛋白質(zhì)，室溫下 8000r/miin 離心 10min。l無 菌水溶解沉淀。 （ 2） Buffer B2： 30ml。 （ 2） 50℃ 水溶 510 分鐘，膠完全溶化即可，其間可振蕩助溶 23 次，待溶化后將溶液置于 吸附柱 中， 8000g/分 離心 30s，若一次加不完，可分 多 次離心。 （ 6）將離心柱置于新的離心管中，室溫敞開離心管蓋放置 5～ 10 分鐘，使乙醇揮發(fā)殆盡。 注：以下分別將四組干擾片段構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)記為 、 。 ) （ 3）將菌液轉(zhuǎn)移到 50mL 離心管中，冰上放置 10min。 （ 7） 4℃ 離心 10min（ 4000r/min）。 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 20 （ 2） 取兩支感受態(tài)細(xì)胞懸液，各 加入 5μL 上述連接產(chǎn)物，輕輕搖勻，同時(shí)設(shè)立轉(zhuǎn)化陽性對(duì)照組（加 1μL pUC19 質(zhì)粒）和陰性對(duì)照組（不加質(zhì)粒）?；靹蚝笕?100μL 涂布于含 Amp的篩選平板上，正面向上放置 30 分鐘，待菌液完全被培養(yǎng)基吸 收后倒置培養(yǎng)皿， 37℃培養(yǎng) 1624h（培養(yǎng)箱中）。 測(cè)序鑒定重組載體 將小提鑒定結(jié)果正確的質(zhì)粒送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限司，以載體反向引物為測(cè)序引物。 kb marker ； 2. ； 和 BamHI 雙酶切； 4. HindIII 單酶切 圖 33 雙酶切 DNA ladder