【正文】 NA 可以降解成新的 siRNA，在這個循環(huán)中表現(xiàn)出 放大效應(yīng) [10]。任何單個堿基的改變即導(dǎo)致RNAi 失效， RNAi 能特異性降解 mRNA，針對同源基因共有序列的 RNAi 則可使同源基因全部失活。但是， Elbashir S M等的設(shè)計方法 siRNA 篩選效率仍然很低， 要更好的掌握 RNAi，提高效率， 理性設(shè)計siRNA有效序列成為 siRNA 研究的重要方向 。 目前使用的已知載體除了大腸桿菌中的質(zhì)粒、 λ 噬菌體、 M13 噬菌體、噬菌粒外，還有酵母、細菌人工染色體載體以及動、植物病毒載體等 [19] 作為基因工程中使用的載體必須具備以下條件： （ 1）有復(fù)制起點，在受體細胞中能自我復(fù)制，或整合到染色體 DNA 上隨染色體DNA 的復(fù)制而同步復(fù)制； （ 2）具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點； （ 3）具有篩選轉(zhuǎn)化子的選擇性標記基因； （ 4）分子量小，拷貝數(shù)多； （ 5）具有較高的外源 DNA 的載裝能力； （ 6）安全，不含對受體細胞有害的基因，不會任意轉(zhuǎn)入受體細胞 以外的其它生物細胞中。 RNA 干擾實驗通常選用質(zhì)粒作為載體。在瓊脂糖凝膠電泳時，同種質(zhì)粒的 三種構(gòu)型 遷移速率各不相同， 超螺旋構(gòu)型 的共價閉合環(huán)狀 DNA 走得最快，其次是線狀 DNA，最慢的是開環(huán) DNA。 MRP1 表達水平最高的組織包括：肺，睪丸，腎，心和胎盤； MRP1 的生理作用 MRP1 在作為機體主要防線的組織中分布，以及 MRP1 的底物特異性，表明 MRP1 有保護機體免受外源生物質(zhì)和內(nèi)源毒性代謝物侵害的生理作用。 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 7 基因治療 基因治療是腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)的手段之一，所謂基因治療是指利用遺傳或分子生物學(xué)方法將外源基因?qū)松矬w內(nèi)或人體細胞內(nèi)，以彌補所缺失的基因或關(guān)閉、降低異?；虻谋磉_，從而對疾病進行治療。 直到 1998 年， Andrew Fire 等證實 Guo 等發(fā)現(xiàn)的正義 RNA抑制同源基因表達的現(xiàn)象是由于體外轉(zhuǎn)錄制備的 RNA 中污染了微量 dsRNA 而引發(fā)， Andrew Fire 和 Craig Mello 將這一現(xiàn)象命名為 RNAi，并于 1998 年在 Nature上發(fā)表了相關(guān)論文。 本論文的研 究目的及意義 癌癥嚴重威脅著人類的健康，其發(fā)病率呈上升趨勢。 3．質(zhì)粒 載體 經(jīng) Hind Ⅲ 和 BamH I 雙酶切，并進行膠回收 。 10TBE 電泳緩沖液： Tris 堿 54g，硼酸 ， EDTA（ 5M， ） 20ml， ddH2O定容至 500ml。 (6) 70%乙醇：取 300mL 無水乙醇溶于 700mL 水中。預(yù)冷溶菌酶、溶液 Ⅰ 和溶液 Ⅲ 。緩慢顛倒數(shù)次，防止破壞基因組 DNA，室溫放置 3min。 再次沉淀核酸。 （ 14）加等體積含 13％（ w/v）聚乙二醇（ PEG 8000）的 ,充分混合， 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 18 用微量離心機于 4℃ 以 120xx 轉(zhuǎn) /分，離心 15 分鐘，以回收質(zhì)粒 DNA。 雙酶切 反應(yīng)體系如下： （ ） 2μL HindⅢ （ 10U/μL） 1μL BamHI （ 10U/μL） 1μL 10buffer tangoTM with BSA 2μL dd H2O 14μL 反應(yīng)條件： 37℃ 3h, 80℃ 20min 。 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 19 （ 4）重復(fù)步驟 4。 （ 2）取 菌液 轉(zhuǎn)接到 LB液體培養(yǎng)基中， 37℃ 培養(yǎng) 23h。 （ 9）分裝細 胞，每 200μL 一份，此細胞為感受態(tài)細胞。 PCR 反應(yīng)條件為： 模 板 單菌落 10buffer μL dNTP（ 10mmol/L） μL 正向引物（載體通用引物） μL 反向引物（載體通用引物） μL Taq 酶（ 2U/μL） μL ddH2O μL 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 21 模 板 單菌落 10buffer without MgCl2 μL MgCl2 （ 25 mmol/L） μL dNTP （ ） μL 正向引物（載體通用引物） 1μL 反向引物（載體通用引物） 1μL Taq 酶（ 2U/μL） μL ddH2O μL 94℃ 預(yù)變性 2 分鐘； 94℃ 變性 30s， 55℃ 退火 30s， 72℃ 延伸 45s，共 35 個循環(huán)；72℃ 延伸 1 分鐘， 4℃ 保存， ％瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)物。 1 2 3 圖 34 膠回收質(zhì)粒 片段 1kb marker 質(zhì)粒經(jīng) Hind Ⅲ 單酶切產(chǎn)物 回收的雙切產(chǎn)物 Recovery products of linear plasmid 1kb marker Ⅲ Recovery products of plasmid digested by double enzymes 6000bp 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 24 重組載體的菌落 PCR 重組載體菌落 PCR 電泳結(jié)果見圖 35，結(jié)果顯示 PCR 擴增產(chǎn)物 ,電泳分析發(fā)現(xiàn)陽性產(chǎn)物可以擴增出 560bp 大小的條帶，假陽性產(chǎn)物不能擴增出 560bp 大小的條帶 ,與預(yù)期結(jié)果相符，可以初步篩選出陽性產(chǎn)物。 重組質(zhì)粒大提的 OD值檢測 按照優(yōu)化的堿裂解法大提質(zhì)粒， 稀釋 50 倍后 利用 Genespec 進行 OD 值檢測 。 （ 4） 向 各 管中加入 1mL LB 液體培養(yǎng)基（不含 Amp），混勻后 37℃ 振蕩培養(yǎng) 1h，保證恢復(fù) 細菌正常生長狀態(tài)，并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因（ Amp）。 （ 5）倒出培養(yǎng)液，將管口倒置以便培養(yǎng)液流盡。 （ 8） 9000g/分離心 1 分鐘，管底溶液即為雙酶切后質(zhì)粒載體。 （ 4） Elution Buffer： 5ml，可以用 TE 緩沖液或無菌水代替。 （ 17） 小心吸上清與另一離心管中，加 2 倍體積的預(yù)冷無水乙醇，再加 體積的NaAC（ 3mol ， ）以除去酚，冰上沉淀 20min， 4℃ 下 10000r/min 離心 15min，使DNA 沉淀出來。 此步驟可以沉淀 DNA。 （ 8）加 倍體積 （約 54ml） 的異丙醇，充分混勻，室溫放置 15min，以沉淀核酸。 8000r/min 離心 5min，棄上清，得沉淀。 干涉靶點在 mrp1 基因 mRNA 全序列中的位置如下 (粗體代表靶序列 )： 1 ccaggcggcg ttgcggcccc ggccccggct ccctgcgccg ccgccgccgc cgccgccgcc 61 gccgccgccg ccgccgccag cgctagcgcc agcagccggg cccgatcacc cgccgcccgg 121 tgcccgccgc cgcccgcgcc agcaaccggg cccgatcacc cgccgcccgg tgcccgccgc 181 cgcccgcgcc accggcatgg cgctccgggg cttctgcagc gccgatggct ccgacccgct 241 ctgggactgg aatgtcacgt ggaataccag caaccccgac ttcaccaagt gctttcagaa 301 cacggtcctc gtgtgggtgc cttgttttta cctctgggcc tgtttcccct tctacttcct 361 ctatctctcc cgacatgacc gaggctacat tcagatgaca cctctcaaca aaaccaaaac 421 tgccttggga tttttgctgt ggatcgtctg ctgggcagac ctcttctact ctttctggga 481 aagaagtcgg ggcatattcc tggccccagt gtttctggtc agcccaactc tcttgggcat 541 caccacgctg cttgctacct ttttaattca gctggagagg aggaagggag ttcagtcttc 601 agggatcatg ctcactttct ggctggtagc cctagtgtgt gccctagcca tcctgagatc 661 caaaattatg acagccttaa aagaggatgc ccaggtggac ctgtttcgtg acatcacttt 721 ctacgtctac ttttccctct tactcattca gctcgtcttg tcctgtttct cagatcgctc 781 acccctgttc tcggaaacca tccacgaccc taatccctgc ccagagtcca gcgcttcctt 841 cctgtcgagg atcaccttct ggtggatcac agggttgatt gtccggggct accgccagcc 901 cctggagggc agtgacctct ggtccttaaa caaggaggac acgtcggaac aagtcgtgcc 961 tgttttggta aagaactgga agaaggaatg cgccaagact aggaagcagc cggtgaaggt 1021 tgtgtactcc tccaaggatc ctgcccagcc gaaagagagt tccaaggtgg atgcgaatga 1081 ggaggtggag gctttgatcg tcaagtcccc acagaaggag tggaacccct ctctgtttaa 1141 ggtgttatac aagacctttg ggccctactt cctcatgagc ttcttcttca aggccatcca 1201 cgacctgatg atgttttccg ggccgcagat cttaaagttg ctcatcaagt tcgtgaatga 1261 cacgaaggcc ccagactggc agggctactt ctacaccgtg ctgctgtttg tcactgcctg 1321 cctgcagacc ctcgtgctgc accagtactt ccacatctgc ttcgtcagtg gcatgaggat 1381 caagaccgct gtcattgggg ctgtctatcg gaaggccctg gtgatcacca attcagccag 1441 aaaatcctcc acggtcgggg agattgtcaa cctcatgtct gtggacgctc agaggttcat 1501 ggacttggcc acgtacatta acatgatctg gtcagccccc ctgcaagtca 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