【正文】 化菌異?？碧教烊粴獠? 天然氣工業(yè),2005:25 (3) :41～43[摘要] 在地層壓力的驅(qū)動下, 油氣藏的輕烴氣體持續(xù)地向地表作垂直擴散和運移。野外測量采用衛(wèi)星定位儀定點,測網(wǎng)間距為500 500 m。進行選擇性培養(yǎng)可以將甲烷氧化菌從其它細菌中分離出來。通過對油田20 個測點土壤中甲烷氧化菌數(shù)量及相關(guān)井位的研究,結(jié)果表明甲烷氧化菌的數(shù)量可以作為指示天然氣藏分布的指標(biāo)。第二階段, 甲烷產(chǎn)生菌在厭氧層被激活, 產(chǎn)生CH4 溶于原油后, 就會增加原油的流動性, 進而提高石油采收率。向廷生，何正國，佘躍惠等，微生物提高原油采收率的機理研究，石油勘探與開發(fā)，1998,25（4）：53－57[摘要] 以地層微生物地化活動的活化作用為基礎(chǔ)的提高石油采收率生物技術(shù), 在大港孔店油田做了先導(dǎo)性試驗(2001～2004 年) 。本文采用從油田水中分離出的菌種,以青海七個泉油田原油為研究對象,進行了較詳細的室內(nèi)實驗研究,目的是弄清所篩選出的微生物對七個泉油田原油的作用及效果,以尋求提高該油田原油采收率的新途徑。2 ,原油受微生物作用后物性變化較大,粘度、凝點、蠟含量均降低。本源MEOR 先導(dǎo)性試驗表明, 地層水中的微生物指標(biāo)與生產(chǎn)井的產(chǎn)量有關(guān), 通過試驗多采出16000 余噸原油。甲烷氧化菌的數(shù)量與其活性具有正相關(guān)性,但不具有明顯的規(guī)律特征。通過檢測烴氧化菌的數(shù)量和活性,可以判斷地表微生物異常,從而指示地下油氣藏的分布〔2〕。天然氣中98 %以上是甲烷氣,甲烷易于往地表擴散,甲烷氧化菌的異?？梢灾甘镜叵碌V藏的分布。2. 甲烷氧化菌培養(yǎng)基組成　　甲烷氧化菌培養(yǎng)基: KH2 PO4 1. 0 g ,Na2 HPO42. 9 g ,MgSO4 , 探討了不同的甲烷氧化菌分離方法。進行選擇性培養(yǎng)可以將甲烷氧化菌(MOB) 從其他細菌中分離出來。利用這一差別可以檢測土壤中輕烴的豐度。4) MOB活性測定　稱取20g土樣加入到干熱滅菌處理的血清瓶中, 蓋上軟塞并向其中注入5ml甲烷, 蓋上外蓋于30℃恒溫培養(yǎng)。4) 經(jīng)分離純化所獲得的另一株菌的單個菌落在顯微鏡下可觀察到不同形態(tài)的菌體, 有圓球狀, 二鏈球狀, 鏈球狀及菌絲體狀。微生物提高原油采收率, 是將選擇的微生物注入油層, 隨之它們在油藏內(nèi)生存、代謝、增殖和運移,這些將有助于進一步降低在二次采油方法開采后留在油藏中的殘余油。 然后向巖心中注入菌液, 注完后將巖心從夾持器中取出, 置于50 ℃生化箱中培養(yǎng)72 h。這些菌種對于遼河、江漢、南陽等油田的稠油開采有較好的應(yīng)用前景。根據(jù)油藏地質(zhì)和工程、開發(fā)狀況及生化參數(shù)分析結(jié)果,確定了注入混氣營養(yǎng)物激活本源微生物生長來提高采收率試驗方案。我國大慶油田三次采油增產(chǎn)1 t 原油的額外成本約為200～300 元,由此可知本源微生物驅(qū)(MEOR) 在成本上的優(yōu)勢。(3) 由于生物技術(shù)的應(yīng)用, 孔店油田23 口生產(chǎn)井的4 口井( 1017 1008 1017 1094 1 井) 的產(chǎn)出液中原油產(chǎn)量增加, 含水量減少, 數(shù)口井(1015 1091032 , 1032 10163 、1017 1050 3 及其它井) 的原油產(chǎn)量趨于穩(wěn)定。在中斷了30 多年之后, 我國的微生物勘探技術(shù)(MPOG) 研究又重新邁開了步伐, 以往的實踐為今后的發(fā)展打下了基礎(chǔ)。它們的分離方法、功能和生長代謝特性有待于深入研究, 以便篩選用于提高該油田原油采收率的采油功能菌群。 古菌: F : 52TCC GGT TGA TCC TGC CRG23 。袁志華,梅博文,佘躍惠,二連盆地馬尼特坳陷油氣微生物勘探,石油勘探與開發(fā),2002,29(6):6465摘　要: 在好氧及厭氧實驗條件下發(fā)現(xiàn), 烴氧化菌和硫酸鹽還原菌(SRB) 的混合菌可以直接消耗原油, 使原油的組分發(fā)生變化。也就是說, 微生物降解烴類要分兩步進行。另一種化學(xué)來源可能是原油中有機硫化物的裂解。同時, 這也意味著, 如果硫酸鹽還原菌生長和繁殖所能依賴的溫度、鹽度和SO 24 含量等條件滿足的話, 在中—淺埋深的油氣藏中仍能發(fā)生烴類的降解作用。1. 2. 1 　原油降解試驗以青海油田7 個泉油田19 井原油為試驗油樣。(2) 原油經(jīng)微生物作用后會產(chǎn)生有機酸或石油羧酸鹽類表面活性劑等低分子物質(zhì),降低油水界面張力,啟動剩余油的產(chǎn)出,提高石油采收率。繼70 年代大慶油田開展微生物吞吐礦場試驗之后，吉林油田、大港油田、大慶油田也相繼進行了試驗并取得了較好效果。以上幾點都是微生物增油的機理。不同類型的油藏構(gòu)成了復(fù)雜多樣的生態(tài)環(huán)境。在微生物采油技術(shù)研究中,對選定區(qū)塊地層水中微生物群落進行分析,從外源微生物采油技術(shù)角度是為了考察注入的優(yōu)勢菌與地層本源菌的配伍情況,從本源微生物驅(qū)油技術(shù)角度,這是為了選擇性激活地層中有益的本源菌,抑制有害的本源菌。石油烴降解菌大部分為好氧菌,即烴氧化菌。這三種菌中度嗜鹽,最佳生長鹽濃度為10 %NaCl。由于大多數(shù)油田具有高溫特征,分離到的嗜熱發(fā)酵菌比嗜溫發(fā)酵菌要多得多。在DNAPDNA 雜交研究基礎(chǔ)上,鑒定出菌株2 ( Thermococcus celer、T. littoralis) 屬于熱球菌屬(Thermococcus) ,在溫度85 ℃時生長。1. 3. 1 　嗜溫硫酸鹽還原菌油田水中最常被分離出的SRB 屬于脫硫弧菌屬。Desulfotomaculum kuznetsovii 最初從地下熱礦泉水中分離到,隨后從巴黎盆地非水驅(qū)油田的井口樣品中分離到。D. infernum屬革蘭氏陰性菌,屬δ變形桿菌,可利用乙酸鹽、丁酸鹽、棕櫚酸鹽及乙醇,最佳生長溫度為60 ℃。1. 4 　產(chǎn)甲烷菌(Methanogenic bacteria)產(chǎn)甲烷菌為嚴(yán)格厭氧菌。該菌輕度嗜鹽,利用甲醇、甲胺和二甲基硫化物作底物。在油田水中可能存在與氫營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌或硫酸鹽還原菌互養(yǎng)共生的乙酸鹽氧化菌。激活本源微生物提高原油采收率在現(xiàn)場應(yīng)用的一種方式是選擇性封堵(生物調(diào)剖) 。注入糖蜜質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4 %的營養(yǎng)物段塞的效果最佳,本源微生物繁殖快,獲得的采收率高。2. 2 　篩選優(yōu)勢菌種發(fā)酵注入地層提高采收率菌種篩選是外源微生物采油技術(shù)的關(guān)鍵。除了從自然界中廣泛篩選采油微生物外,還可以通過生物工程、遺傳工程和基因工程來構(gòu)建基因工程菌。Voordouw G, et al . [26 ] 通過16S rRNA 基因擴增克隆測序研究了加拿大北部油田微生物群落的多樣性,檢測到多種革蘭氏陰性的SRB、厭氧菌、發(fā)酵菌和產(chǎn)醋酸菌。通過利用通用引物進行PCR 擴增微生物的16S rRNA 基因片斷。由于石油儲層中可培養(yǎng)微生物與本源微生物多樣性之間的偏差,評價人工培養(yǎng)菌種在地層本源微生物群落中的地位是困難的。將測序結(jié)果與基因銀行進行比對結(jié)果表明, 油砂山樣品中有大量海桿菌屬和甲胞菌屬, 樣品中還發(fā)現(xiàn)存在產(chǎn)甲烷古菌及一些不可培養(yǎng)的其它古菌類群。PCR儀、4 ℃水浴鍋、凝膠成像UV系統(tǒng)。　樣品基因組16S rDNA全長克隆測序用pGEM2T easy vector system ( Promega公司) 將16S rDNA全長擴增片段與載體連接, 連接產(chǎn)物通過CaCl2 法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中, 挑陽性單克隆進行測序分析(App lied Biosystems) 。通過檢測甲烷氧化菌及烴氧化菌的數(shù)量和活性, 可以判斷地表微生物異常, 從而指示地下油氣藏的分布。通過檢測烴氧化菌的數(shù)量和活性, 可以判斷地表微生物異常, 從而指示地下油氣藏的分布。另一類可利用C2 ～C5 輕烴作碳源的細菌在有微量烴類存在的環(huán)境中即可生長, 這類細菌的專一性較差, 除利用烴類外, 也可利用多糖和其他有機物。共采集19個樣品, 帶回實驗室后于4℃低溫保存。顯微觀測液態(tài)培養(yǎng)物的細胞形態(tài):①G1土樣懸液, 放大40倍形態(tài)特征為微球狀。 另一種為青色, 類似于霉菌。4　結(jié)　　論1) 通過對土樣進行不同的選擇性培養(yǎng)及隨后的分離純化工作, 得到了兩株形態(tài)特異的甲烷氧化菌, 是否屬于新的種屬仍有待于進一步研究。通過單因素實驗得到了YY 12 處理廢水中石油烴的最佳溫度為33 ℃, 接種量為15%, pH 為7。筆者針對未經(jīng)預(yù)處理的鉆井廢水, 從油污土壤中分離篩選出了一株可直接用于處理鉆井廢水的高效降油菌株, 并通過實驗探索了其對石油烴的最佳降解條件。含油培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入柴油作為唯一碳源。1 微生物采油技術(shù)發(fā)展概況目前，微生物采油技術(shù)（MEOR）主要分美國和俄羅斯兩大學(xué)派，前者采用培養(yǎng)篩選菌種注入油藏，后者則是利用營養(yǎng)物激活本源微生物，二者都是利用其代謝產(chǎn)物作為驅(qū)油劑提高石油采收率。2. 微生物采油的研究進展微生物采油技術(shù)經(jīng)過多年的礦場試驗和應(yīng)用，取得了較為明顯的效果。充分利用現(xiàn)代科技技術(shù)，有望解決目前微生物采油工程中存在的問題。其采油機理為:一是改變原油組成,二是改善驅(qū)油環(huán)境,最終使原油流向井底,提高采收率。將篩選的微生物注入到低滲透率的巖心中,從微生物驅(qū)油效率、注入壓力和微生物通過巖心的菌液濃度變化等方面研究了微生物的運移能力,并對通過恒速壓汞技術(shù)測出的巖心孔喉半徑與微生物個體大小的匹配關(guān)系進行了分析。憑借這些新工具，可以進一步弄清微生物在不同地層條件油藏（或模擬實驗）中具體的生長、代謝活動和運移情況，對微生物驅(qū)油機理的研究提供了有利幫助。19901993年，在Phoenix油田運行了第二輪試驗，%，驗證了微生物采油的可行性。在國內(nèi)外，微生物采油技術(shù)的先導(dǎo)性礦場試驗已初見成效，較為典型的數(shù)美國和俄羅斯，我國的吉林、勝利等油田也進行了礦場試驗，增油效果鼓舞人心。 培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基: g, 蛋白胨10 g, NaCl 15 g,蒸餾水1 L, pH 。油氣田開發(fā)工程作為資源開發(fā)型建設(shè)項目, 在為人類提供能源的同時, 會產(chǎn)生大量的鉆井廢水, 給生態(tài)環(huán)境帶來影響。3) 篩分出的兩株MOB中有一株菌落顏色呈青色, 類似于霉菌菌落, 但顯微鏡觀察卻發(fā)現(xiàn)該細胞形體很大且不能被革蘭氏染色法染色。4) 固體斜面純化培養(yǎng)的菌落形態(tài)觀察　經(jīng)過固體斜面純化培養(yǎng)分離出兩株MOB, 形態(tài)特征為:①青色菌落, 類似于霉菌, 橢圓形, 個體很大, 100倍油鏡可見細胞核及處于雙核狀態(tài)的細胞。 ③C1 土樣懸液, 放大40倍為球狀, 放大100倍為短桿狀。3) MOB的純化　采用液體10倍稀釋分離培養(yǎng)與固體10倍稀釋滾管分離相結(jié)合的方法進行分離,采用固體斜面純化分離培養(yǎng)物。 而在非輕烴環(huán)境中生長的微生物在C2 ～C5 為碳源的培養(yǎng)基中需要一段適應(yīng)期, 生長緩慢。它僅能利用C1 化合物, 而不能利用糖類或其他有機物, 具有高度的專一性。因此研究新的微生物分離方法已成為微生物勘探技術(shù)推廣應(yīng)用的必然。根據(jù)序列比對結(jié)果, 克隆株菌均與數(shù)據(jù)庫中同一屬的細菌具有大于90%的同源性, 除了菌株CY3外,其余的菌株與數(shù)據(jù)庫中已知菌中的同源性均不超過98% , 但是一般認為16S rRNA序列同源性小于98%時屬于相同屬而不同種, 同源性小于93% ～95%時屬于不同屬。將濾膜取出剪成碎片裝入10 mL的離心管中, 加入360 μL 新鮮的溶菌酶溶液37 ℃溫育1h后加入115 μL SDS ( 10% ) 溶液和25μl蛋白酶K (20 mg/mL) 溫育2 h, 加入400μL的5M NaCl上下顛倒混勻后在其中加入預(yù)熱到65 ℃的280μL CTAB溶液, 65 ℃溫育20 min?！　?gòu)建16S rDNA克隆文庫是微生物分子生態(tài)學(xué)中用來調(diào)查環(huán)境中原核微生物組成的常用方法之一。因此,在微生物純培養(yǎng)的基礎(chǔ)上來研究微生物提高原油采收率機理,并以此來指導(dǎo)微生物的現(xiàn)場試驗還存在很大的不足。而B .licheniformis TRC 18 2 a 不在所分離的油藏樣品中。從生產(chǎn)流體中全部菌落的DNA 構(gòu)建了2 個16S rRNA 基因文庫,使用古細菌或通用寡核苷酸引物。這種菌具有耐高溫、耐鹽的特性,還可以降解原油中的飽和烴、芳烴和膠質(zhì)瀝青質(zhì),代謝產(chǎn)物可以是生物表面活性劑、氣體、酸等。針對油藏特點,采油微生物還需具備如下特點:1) 能夠在油藏條件下旺盛地生長繁殖。研究中發(fā)現(xiàn)碳酸鹽巖儲層能為發(fā)酵提供緩仲作用,它能中和細菌產(chǎn)生的酸,增加二氧化碳的產(chǎn)量,原油的采收率隨著碳酸鹽含量的增加而增加,但當(dāng)碳酸鹽含量超過20 %時,原油的采收率不再增加。菲利浦石油公司在激活和保持本源微生物活性方面申請了多項專利[21 ] ,這些專利都是關(guān)于如何注入地層缺乏而微生物又需要的營養(yǎng)成分。此外,在北海油藏中,乙酸鹽濃度高達20mmolPL ,可能是那些共生微生物的重要能源。. 19942006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. ,桿狀菌嗜甲基產(chǎn)甲烷菌GF 283 從Bondyuzhskoe 油田中分離出,最佳生長鹽度為15 % NaCl。在低鹽度到高鹽度的中溫油藏中都有產(chǎn)甲烷菌存在。T. mobile 是最嗜熱的SRB。它在硫酸鹽存在下,不完全氧化的底物范圍很廣,包括乳酸鹽、乙醇、丁醇和羧酸。而D. ga2bonensis 被認為是中度嗜鹽,最佳生長需5～6 %NaCl。1. 3 　硫酸鹽還原菌(SRB)油藏中硫酸鹽還原菌包括脫硫弧菌屬(Desulfovibrio) 、脫硫腸菌屬(Desulfotomaculum) 和脫硫狀菌屬(Desulfacinum) 。從103 ℃的熱油田中分離到極端嗜熱微生物,人們對此越來越感興趣。從非洲剛果的一個油田分離出一種中度嗜鹽螺旋體( Spirochaeta Smaradinae) [6 ] 。Nazina T. N 等[3 ] 從Kazakhstan 和West Siberia 油田分離到嗜熱的烴氧化菌。由于油藏的環(huán)境極其多樣,這些微生物的種類也非常多樣,研究油藏中的微生物群落對于獲得微生物功能基因和開發(fā)新的生物制品有重要意義。油藏基質(zhì)為結(jié)構(gòu)尺寸變化多樣的孔隙介質(zhì)，孔隙介質(zhì)中充滿著油、氣和水，隨沉積環(huán)境不同，油、氣、水性質(zhì)差別很大。油藏極端環(huán)境對微生物群落結(jié)構(gòu)組成和數(shù)量也會有大的影響。 然而由于種種原因K