【正文】 提出了用喉道半徑與微生物個(gè)體大小的匹配關(guān)系取代滲透率,并將其作為低滲透油藏微生物采油篩選條件的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。雖然微生物采油技術(shù)在國內(nèi)外都進(jìn)行了許多先導(dǎo)性的試驗(yàn)，效果較為顯著。19881996年，俄羅斯的11個(gè)油田區(qū)塊的44個(gè)注水井組應(yīng)用本源微生物驅(qū)油技術(shù)，共增產(chǎn)原油2110^4t。微生物采油的應(yīng)用也從開始的單井處理逐漸向整個(gè)區(qū)塊或油田發(fā)展，并見到了明顯效果。6H2O g, MgSO4除了生產(chǎn)井之外, 還有大量的探測井、檢查井的鉆探也會(huì)產(chǎn)生鉆井廢水, 所以它又具有分散性和隱蔽性的特點(diǎn)〔2〕。其分類學(xué)鑒定尚需深入的研究。產(chǎn)生這種低氧化速率的原因是由于土樣的低含水量所引起的。取出培養(yǎng)液進(jìn)行顯微觀察, 這些細(xì)菌呈現(xiàn)出球形、短桿形及鏈桿形。2　分離鑒定1) 液體培養(yǎng)D培養(yǎng)物形態(tài)觀察　液體培養(yǎng)D的血清瓶壁(瓶口塞有棉花) 上有一圈白色帶, 且液面有一薄層白色膜, 此膜可能是好氧性的是甲基菌。天然氣中98%以上是甲烷氣, 甲烷氧化菌的異常可以指示地下氣藏的分布。甲烷新陳代謝的過程由Leadbetter首先提出。并且用氣相色譜對甲烷氧化菌活性進(jìn)行了測定。根據(jù)基因銀行比對和全球微生物資源資料分析, 可得到很多有價(jià)值的信息, 從而為該油田采油功能微生物和菌群的研究及篩選提供依據(jù)。用DyNA Quant 200 ( Pharmacia Biotech) DNA濃度測定儀來測定DNA濃度。這對于研究油藏條件下本源微生物生態(tài), 發(fā)現(xiàn)和培養(yǎng)新的微生物, 以及篩選采油優(yōu)勢功能菌具有重要意義。向廷生,王莉,張敏,油藏微生物及其在石油工業(yè)中的應(yīng)用,生物技術(shù),2005,15(4):8790基金項(xiàng)目:湖北省自然基金項(xiàng)目(2004ABA144) 。通過DNA DNA 雜交該菌株在種的水平上與海棲熱袍菌( T. maritima) ,那不勒斯棲熱袍菌( T. neapolitana) 和溫泉棲熱袍菌( T. thermarum) 沒有相似性。古細(xì)菌文庫與產(chǎn)甲烷菌類似的rDNAs 占優(yōu)勢,少量的克隆為熱球菌。同時(shí),各油田開始建立MEOR 實(shí)驗(yàn)室,從油田水中分離培養(yǎng)適合本油田的MEOR 菌種[25 ] 。雖然微生物代謝產(chǎn)物十分復(fù)雜,但從提高采收率機(jī)理來看,代謝產(chǎn)物主要為:氣體、酸、有機(jī)溶劑、生物表面活性劑及生物聚合物等。1993 年至1994 年,俄羅斯西伯利亞的Vyngapour 油田用當(dāng)?shù)厥称芳庸U水中的細(xì)菌和注入營養(yǎng)物質(zhì)激活地下原生細(xì)菌,進(jìn)行了本源微生物驅(qū)油礦場試驗(yàn),試驗(yàn)區(qū)塊地層溫度高達(dá)94 ℃,在含水98～99 %的基礎(chǔ)上,采收率平均提高10 % , 原油含水下降3 ～ 4 % , 累計(jì)增油6192噸[19 ] 。沙特阿拉伯Abdel Whly A A , et al . (1999) [22 ] 利用重質(zhì)原油和原生水研究了本源微生物的生長對水的粘度、pH 值和油P水界面張力的影響。這些微生物菌落對石油的生產(chǎn)都有一定的影響。北海油藏中的地層水在60 ℃、80 ℃、92 ℃條件下,以乙酸鹽為底物的富集培養(yǎng)過程中可以產(chǎn)生甲烷。此外,甲胺的濃度(一種產(chǎn)甲烷底物) 隨地層水礦化度增加而增加。閃爍古生球菌( Archaeoglobus fulgidus) 從北海挪威熱油田水中分離到[16 ] 。在北海Gullfaks 油田盡管用富集培養(yǎng)方法沒有檢測到脫硫腸菌屬,但用專一性熒光抗體技術(shù)檢測到其存在[14 ] 。它自氧生長,因此,很容易與上面提到的三種脫硫弧菌區(qū)分開。某些菌種還可以降解石油中的組分,改善原油的流動(dòng)性,提高原油采收率。從熱的低鹽度的油藏中經(jīng)常會(huì)分離到熱厭氧桿菌屬微生物。Davydova Charakhch’yan I A , etal . [7 ]從Tatarria west 和Siberia 油田地層水中分離到一新的產(chǎn)乙酸厭氧微生物( Acetoanaerobium romashkovii) 。該菌鑒定為嗜熱嗜油芽孢桿菌( B . thermoleovorans) 。這類細(xì)菌在注水井及近井地帶最為豐富,是注水地層中微生物食物鏈的啟動(dòng)環(huán)節(jié)[1 ] 。油田經(jīng)長期注水開發(fā),地層中已形成了較為穩(wěn)定地微生物群落。還介紹了激活本源微生物和篩選外源微生物在提高石油采收率方面的應(yīng)用。，產(chǎn)生長鏈分子脂肪酸及含羰基化合物等生物表面活性劑作用的物質(zhì)。90 年代微生物采油技術(shù)在羅馬尼亞、前蘇聯(lián)、美國等國家和地區(qū)的礦場成功試驗(yàn)K標(biāo)志其工業(yè)應(yīng)用階段已經(jīng)到來。方法是先填制一定滲透率的人造砂管巖芯,用模擬青海油田地層水測水相滲透率Kw ,然后向巖芯中擠入并飽和青海油田原油,用模擬地層水進(jìn)行驅(qū)油試驗(yàn),直至沒有原油流出為止,記錄水驅(qū)油的采收率。2口井的現(xiàn)場試驗(yàn)證明,微生物采油具有良好的提高石油采收率的效果和清蠟減阻效果。參考文獻(xiàn)[3 ]等報(bào)道了硫酸鹽還原菌直接利用原油中的脂肪烴和芳烴的實(shí)驗(yàn)。油藏中的硫化氫的化學(xué)來源有如下兩種途徑。其中, 微生物硫酸鹽還原作用被認(rèn)為是自然界中一種重要的使有機(jī)質(zhì)發(fā)生蝕變的作用。烴氧化菌。 試劑和儀器有酵母膏( Yeast Ex2t ract) 、蛋白胨( Typtone) 、瓊脂糖(Agrose) 、DNA 聚合酶和10′Buffer (博采公司) 、V2gene DNA純化試劑盒、PEMG2T easy vector 連接試劑盒( Promaga) 、PCR 儀、4 ℃水浴鍋及凝膠成像UV 系統(tǒng)。只有造就了一批擁有微生物學(xué)、生物化學(xué)、地球化學(xué)、石油地質(zhì)學(xué)和石油工程學(xué)等多學(xué)科理論和技術(shù)的專門人才或者實(shí)現(xiàn)了這些相關(guān)學(xué)科人才的有效結(jié)合, 才可能創(chuàng)造出中國自己的成套地質(zhì)生物技術(shù), 才能為提高我國石油天然氣勘探開發(fā)的規(guī)模效益做出卓有成效的貢獻(xiàn)。在新的世紀(jì)里, 這種發(fā)展趨勢更加明顯地展現(xiàn)在人們面前。根據(jù)油藏地質(zhì)和工程、開發(fā)狀況及生化參數(shù)分析結(jié)果,確定了注入混氣營養(yǎng)物的激活本源菌來提高采收率的試驗(yàn)方案。在利用現(xiàn)有工藝技術(shù)進(jìn)行一次、二次、三次采油之后,還有40 %～60 %的原油滯留在油藏中未采出。向廷生,佘躍惠 ,N. T. Nazina 等，港西油田北3 區(qū)塊本源微生物驅(qū)油潛力研究，河南石油，2005，19(5)：3335摘要:本源微生物采油不存在菌種適應(yīng)性、變異退化等問題,減少了菌種的發(fā)酵、注入等操作程序,工藝簡單、投資少、成本低。3) 實(shí)驗(yàn)菌種生長適應(yīng)的pH 值范圍較廣, 為510～ 1110, 最適宜的pH 值為810。菌種是取遼河油水樣通過富集分離培養(yǎng)的, 有4 株單一菌和1 株混合菌共5 個(gè)菌種。 一般在礦化度為8%～ 12% 時(shí)均能生長。2) 甲烷氧化菌活性測定實(shí)驗(yàn)表明在含水量很低的情況下(土樣幾乎呈粉末狀) 甲烷氧化菌對外源性甲烷的氧化能力非常有限。共采集19個(gè)樣品, 帶回實(shí)驗(yàn)室后于4℃低溫保存。另一類可利用C2 ～C5 輕烴作碳源的細(xì)菌在有微量烴類存在的環(huán)境中即可生長, 這類細(xì)菌的專一性較差, 除利用烴類外, 也可利用多糖和其他有機(jī)物。通過檢測烴氧化菌的數(shù)量和活性, 可以判斷地表微生物異常, 從而指示地下油氣藏的分布。通過檢測甲烷氧化菌及烴氧化菌的數(shù)量和活性, 可以判斷地表微生物異常, 從而指示地下油氣藏的分布。由于該油田地下水位較高,應(yīng)該在地下水位上采樣,所以深度一般為1. 2～1. 5m。甲烷新陳代謝的過程由Leadbet ter〔4〕首先提出。該方法作為天然氣勘探的一種輔助手段,具有快速、低成本的優(yōu)點(diǎn)。 到2004 年底。這項(xiàng)生物技術(shù)的使用引起地層微生物的活化, 這個(gè)活化首先是在注水井的近井底區(qū)域, 接著是在沿著水動(dòng)力學(xué)方向一致的區(qū)域進(jìn)行。高碳數(shù)正構(gòu)烷烴降解成低碳數(shù)烷烴。 芳烴骨架不受影響,支鏈斷裂。第一階段, 需氧烴降解微生物的活性增加, 導(dǎo)致地層水碳酸氫鹽和乙酸鹽含量的增加。 取得了良好效果。在地層壓力的驅(qū)動(dòng)下,油氣藏的輕烴氣體持續(xù)地向地表作垂直擴(kuò)散和運(yùn)移〔1〕。已知微生物首先通過甲烷加氧酶活化甲烷,在有氧條件下生成甲醇,進(jìn)一步氧化可生成甲醛。樣品應(yīng)盡可能在10 ℃以下保存,帶回實(shí)驗(yàn)室時(shí)后自然風(fēng)干,研細(xì)后過100 目篩。傳統(tǒng)的分析方法是采用經(jīng)典的微生物分離純化技術(shù), 操作過程煩瑣, 且工作量大。甲烷氧化菌屬于一類特殊的烴氧化菌群。長期在微量輕烴環(huán)境中生長的微生物在C2 ～C5 為碳源的培養(yǎng)基中也可以迅速生長。2) 土樣預(yù)處理　取50g土樣于無菌操作臺(tái)晾干, 并粉碎成細(xì)顆粒狀(近粉末狀) 。3) 篩分出的兩株MOB中有一株菌落顏色呈青色, 類似于霉菌菌落, 但顯微鏡觀察卻發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞形體很大且不能被革蘭氏染色法染色。 它們與遼河、江漢、南陽油田地層水的配伍性都很好。實(shí)驗(yàn)主要考查細(xì)菌在油層狀況下的生長與對稠油的降粘能力。4) 實(shí)驗(yàn)菌種與供實(shí)驗(yàn)用的遼河、江漢、南陽油田地層水與油的配伍性均好。應(yīng)用本源微生物驅(qū)油技術(shù)可以改善油藏條件,提高原油最終采收率。微生物采油(MEOR) 是一種成本低廉的開采剩余油的有效途徑,近10 a 來在國內(nèi)外發(fā)展很快[5～7 ] 。(1) 微生物活性導(dǎo)致原油氧化和生態(tài)系統(tǒng)物理化學(xué)特性的改變, 水中可溶性碳酸鹽的濃度從014～ 016 gPL 增加到017 ～ 1183 gPL ( 1094 1017 1008 1050 3 井) , 在1017 2 井中其濃度達(dá)到1183 gPL。石油和天然氣工業(yè)是國家重要的基礎(chǔ)能源工業(yè), 其上游工程——石油和天然氣勘探開發(fā)當(dāng)前面臨新的形勢和發(fā)展機(jī)遇, 提高石油和天然氣勘探開發(fā)的效益已成為緊迫的任務(wù), 而研發(fā)和應(yīng)用廉價(jià)而有效的生物技術(shù)是完成這一任務(wù)的一種新的技術(shù)手段。本文試圖對地質(zhì)微生物技術(shù)在石油天然氣勘探開發(fā)中的應(yīng)用現(xiàn)狀加以評述。16SrRNA 基因PCR 擴(kuò)增引物[ 1 ,2 ] : 細(xì)菌: F : 52A GA GTT TGA TCC TGG CTC A G23 。油顯示油氣微生物勘探(MPOG) 技術(shù)是一種新的地表油氣勘探方法,可以預(yù)測非常規(guī)油氣藏和深部油氣藏,確定圈閉的含油氣級(jí)別和油氣分布,指明油氣藏泄油氣位置,具有直接、有效、多解性小而經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢,日益受到全球油氣勘探界的重視[1 ,2 ] 。大量的地質(zhì)實(shí)例顯示, 油氣儲(chǔ)層附近常含有高的H2S 氣體或黃鐵礦、蝕變的烴類和由輕同位素組成的CO 2氣體或方解石膠結(jié)物[ 1 ]。一種是有機(jī)原油組分作為還原劑的化學(xué)硫酸鹽還原作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明了硫酸鹽還原菌與烴氧化菌一樣具有降解石油烴的能力。微生物提高石油采收率(Microbial Enhanced Oil Recovery ,簡稱MEOR) 技術(shù)自20 世紀(jì)30 年代提出,已逐步引起世界各國的科學(xué)家的重視,其研究與應(yīng)用取得了很大的進(jìn)展,MEOR已被認(rèn)為是最有前途的一種提高石油采收率的方法[1 3 ] 。再向巖芯擠入1. 0～2. 0PV 的菌液,將巖芯取出,置于滅過菌的培養(yǎng)基中,在生化培養(yǎng)箱中50 ℃下培養(yǎng)7d 后,再用地層水驅(qū)替,直至沒有原油流出為止,記錄微生物驅(qū)油的采收率。 目前K微生物驅(qū)油已成為油田現(xiàn)場工業(yè)應(yīng)用中新的提高采收率方法。，能增加巖石孔隙度和改善原油粘度。最后就分子生物技術(shù)在研究油藏中可培養(yǎng)微生物和未培養(yǎng)微生物中的應(yīng)用進(jìn)行了討論。這些微生物主要包括石油降解菌、發(fā)酵菌、產(chǎn)甲烷菌、硫酸鹽還原菌、鐵細(xì)菌及硝酸鹽還原菌等。烴降解菌可以通過自身的代謝作用產(chǎn)生分解酶,裂解重質(zhì)烴類和石蠟,降低原油粘度,改善原油的流動(dòng)性能。1. 2 　發(fā)酵菌嗜溫、嗜熱和極端嗜熱發(fā)酵菌構(gòu)成了油藏環(huán)境的一個(gè)重要微生物群落。這種菌以H2 +CO2 為唯一碳源和能源生長。從法國一熱的陸相油藏中分離到一株熱硫化氫熱厭氧桿菌( Thermoanaerobacterthermohydrosulfuricus) 。但這類菌群的活動(dòng)使產(chǎn)出的油氣中含有硫化氫,增加生產(chǎn)設(shè)施的腐蝕問題,并帶來嚴(yán)重的生產(chǎn)安全問題。用寡核苷酸探針鑒定了在油田環(huán)境中脫硫細(xì)菌屬( Des2ulfobacter) 的一些菌株[11 ] 。另外一些嗜熱SRB 從北海油藏中分離到[15 ] ,它們是: Desulfacinum infernum , Thermodesulforhabdus norvegicus ( T. nor2vegicus ) 及Thermodesulfobacterium mobile ( T. mobile) 。通過DNAPDNA 雜交實(shí)驗(yàn),表明從油田水中分離的微生物同那些深海熱泉分離出的種群具有遺傳相似性。嗜甲基菌Methanohalophilus euhalobius 從鹽度達(dá)140gPL 的開發(fā)井樣品中分離出。但在同樣富集培養(yǎng)條件下沒有得到乙酸裂解產(chǎn)甲烷菌的純培養(yǎng)物。2 　在石油工業(yè)中的應(yīng)用2. 1 　激活本源微生物提高原油采收率本源微生物是指存在于油藏中較為穩(wěn)定的微生物群落,多數(shù)是在油田注水開發(fā)過程中由地表帶入且已適應(yīng)地層環(huán)境保存下來的微生物。通過驅(qū)替實(shí)驗(yàn)研究了營養(yǎng)物的濃度、培養(yǎng)溫度和碳酸鹽含量對水驅(qū)殘余油采收率的影響。據(jù)報(bào)道[21 ] ,90 年代俄羅斯的本源微生物驅(qū)油技術(shù)在多個(gè)油田應(yīng)用,累計(jì)增油35 萬噸,效果顯著。3) 能夠與地層本源菌配伍。3 　最新研究進(jìn)展3. 1 　用分子生物技術(shù)對油藏中的微生物進(jìn)行分類鑒定隨著分子生物學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育分析方法的發(fā)展,人們運(yùn)用基于16r RNA(rDNA) 基因的分子生物學(xué)來分析復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)。FujiwaraK, et al . [28 ] 利用限制性片斷長度多樣性(RFLP) 分析了向油藏注入的2 種微生物( E. cloacae TRC 322 及B . licheniformis TRC 18 2 a) 的16S rRNA 基因,來監(jiān)測微生物在地層的繁殖和運(yùn)移情況。認(rèn)為是一株新種:地下棲熱袍菌( T. subterranea) 。湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2002A04010)作者簡介:向廷生(1963 ) ,男,碩士,副教授,從事石油地質(zhì)微生物方面的研究,E mail :xiangtingshengsina. 。1　材料與方法　材料(1) 樣品取自青海油砂山油田油井井口油、水樣?！悠坊蚪M16S rDNA全長擴(kuò)增及純化使用基因組16S rDNA全長通用引物擴(kuò)增純菌基因組16S rDNA 全長, PCR 擴(kuò)增體系和程序見文獻(xiàn)[ 3, 4 ] 。佘躍惠,何正國,楊柳岸等，油砂山油田本源微生物