【正文】 進(jìn)入我國(guó)油田市場(chǎng),先后在大港、遼河、勝利、大慶、新疆、吉林、華北等十幾個(gè)油田開展試驗(yàn),并逐漸由單井吞吐、清防蠟處理轉(zhuǎn)向微生物增效水驅(qū)。Voordouw G, et al . [26 ] 通過16S rRNA 基因擴(kuò)增克隆測(cè)序研究了加拿大北部油田微生物群落的多樣性,檢測(cè)到多種革蘭氏陰性的SRB、厭氧菌、發(fā)酵菌和產(chǎn)醋酸菌。文庫(kù)中有代表性的屬有:熱厭氧桿菌屬( Thermoanaerbacter) ,熱球菌屬( Thermococcus) ,脫硫弧菌屬( Desulfothiovibrio) ,氨基桿菌屬(Aminobacterium) ,氨基酸球菌屬( Acidaminococcus) ,假單胞菌屬( Pseudomonas) ,鹽單胞菌屬( Halomonas) ,不動(dòng)桿菌屬( Acine2tobacter) ,鞘氨醇單胞菌屬( Sphingomonas) ,甲基桿菌屬( Methyl2obacterium) 和脫硫微菌屬( Desulfomicrobium) 。通過利用通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增微生物的16S rRNA 基因片斷。通過16S rRNA 序列分析該菌株屬于棲熱袍. 19942006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 。由于石油儲(chǔ)層中可培養(yǎng)微生物與本源微生物多樣性之間的偏差,評(píng)價(jià)人工培養(yǎng)菌種在地層本源微生物群落中的地位是困難的。從分析的樣品中得到了很多新的基因序列,DGGE 圖譜中優(yōu)勢(shì)條帶序列分析表明為未培養(yǎng)微生物,它們與數(shù)據(jù)庫(kù)中α、γ、δ、ε變形桿菌和擬桿菌有很近的親緣關(guān)系。將測(cè)序結(jié)果與基因銀行進(jìn)行比對(duì)結(jié)果表明, 油砂山樣品中有大量海桿菌屬和甲胞菌屬, 樣品中還發(fā)現(xiàn)存在產(chǎn)甲烷古菌及一些不可培養(yǎng)的其它古菌類群。為了調(diào)查青海油田本源微生物種群結(jié)構(gòu), 尋找采油優(yōu)勢(shì)功能菌群, 特別是能夠深入了解存在但目前尚不能培養(yǎng)的微生物類群, 設(shè)計(jì)了兩套分別對(duì)應(yīng)細(xì)菌和古菌的引物, 采用PCR方法直接從油田環(huán)境樣品擴(kuò)增其微生物的16S rRNA 基因, 然后構(gòu)建基因文庫(kù),克隆并進(jìn)行DNA序列分析, 最后用獲得的基因序列在GenBank中查找與其對(duì)應(yīng)的微生物種類。PCR儀、4 ℃水浴鍋、凝膠成像UV系統(tǒng)。取上清加入016 倍體積的異丙醇 20 ℃沉淀3 h, 離心( 14 000 g, 20min) 后去上清液, 將DNA溶于30μL無菌水, 加入115μL RNase A (20 mg/mL) 37 ℃消化20 min?！悠坊蚪M16S rDNA全長(zhǎng)克隆測(cè)序用pGEM2T easy vector system ( Promega公司) 將16S rDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增片段與載體連接, 連接產(chǎn)物通過CaCl2 法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中, 挑陽(yáng)性單克隆進(jìn)行測(cè)序分析(App lied Biosystems) 。3　結(jié)束語(yǔ)根據(jù)青海油田油砂山油田本源微生物樣品分子生物學(xué)初步調(diào)查結(jié)果表明, 該油田地層存在豐富的細(xì)菌和古細(xì)菌, 特別是海桿菌屬和單孢菌屬以及甲烷菌屬, 其中很多為未培養(yǎng)微生物或新細(xì)菌種, 它們的功能和多樣性有待于進(jìn)一步深入研究。通過檢測(cè)甲烷氧化菌及烴氧化菌的數(shù)量和活性, 可以判斷地表微生物異常, 從而指示地下油氣藏的分布。 通過實(shí)驗(yàn)分離出了兩株形態(tài)特異的專一性甲烷氧化菌, 為甲烷氧化相關(guān)基因的克隆提供了材料。通過檢測(cè)烴氧化菌的數(shù)量和活性, 可以判斷地表微生物異常, 從而指示地下油氣藏的分布。Hanson 等綜述了甲基營(yíng)養(yǎng)菌的生態(tài)及其在甲烷物質(zhì)循環(huán)中的作用。另一類可利用C2 ～C5 輕烴作碳源的細(xì)菌在有微量烴類存在的環(huán)境中即可生長(zhǎng), 這類細(xì)菌的專一性較差, 除利用烴類外, 也可利用多糖和其他有機(jī)物。C2 ～C5 烴氧化菌的異?？芍甘镜叵掠筒氐姆植?。共采集19個(gè)樣品, 帶回實(shí)驗(yàn)室后于4℃低溫保存。采用氣相色譜檢測(cè)甲烷含量, 檢測(cè)條件如下: 氫離子火焰檢測(cè)器(F ID) , 進(jìn)樣量012ml , 總流速4018ml/min , 柱流速116ml/min, 柱溫35℃, H2 流速35ml/min, 尾吹流速3015ml/min , 空氣流速240ml/min。顯微觀測(cè)液態(tài)培養(yǎng)物的細(xì)胞形態(tài):①G1土樣懸液, 放大40倍形態(tài)特征為微球狀。當(dāng)培養(yǎng)1周時(shí)間后發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)管內(nèi)有界面膜(即液體培養(yǎng)基與空氣接觸處會(huì)有一層無色膜) , 有的液體培養(yǎng)物內(nèi)部也會(huì)出現(xiàn)白色紗衣狀膜片。 另一種為青色, 類似于霉菌。3　活性測(cè)定在甲烷氧化菌活性測(cè)定的試驗(yàn)中, 甲烷的量變化不大。4　結(jié)　　論1) 通過對(duì)土樣進(jìn)行不同的選擇性培養(yǎng)及隨后的分離純化工作, 得到了兩株形態(tài)特異的甲烷氧化菌, 是否屬于新的種屬仍有待于進(jìn)一步研究。4) 經(jīng)分離純化所獲得的另一株菌的單個(gè)菌落在顯微鏡下可觀察到不同形態(tài)的菌體, 有圓球狀, 二鏈球狀, 鏈球狀及菌絲體狀。通過單因素實(shí)驗(yàn)得到了YY 12 處理廢水中石油烴的最佳溫度為33 ℃, 接種量為15%, pH 為7。鉆井廢水往往與鉆井廢泥漿一起排放, 具有油含量高、成分復(fù)雜、礦化度高、腐蝕性強(qiáng)、毒性大等特點(diǎn)〔1〕。筆者針對(duì)未經(jīng)預(yù)處理的鉆井廢水, 從油污土壤中分離篩選出了一株可直接用于處理鉆井廢水的高效降油菌株, 并通過實(shí)驗(yàn)探索了其對(duì)石油烴的最佳降解條件?；A(chǔ)培養(yǎng)基〔7〕:K2HPO4 g, NH4Cl 1 g, g, CaCl2含油培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入柴油作為唯一碳源。相關(guān)的石油烴降解理論、數(shù)學(xué)模型等也取得了系列成果。1 微生物采油技術(shù)發(fā)展概況目前，微生物采油技術(shù)（MEOR）主要分美國(guó)和俄羅斯兩大學(xué)派，前者采用培養(yǎng)篩選菌種注入油藏，后者則是利用營(yíng)養(yǎng)物激活本源微生物，二者都是利用其代謝產(chǎn)物作為驅(qū)油劑提高石油采收率。19851994 年，在韃靼、西西伯利亞、阿塞拜疆油田激活本源微生物，產(chǎn)量增加1046%。2. 微生物采油的研究進(jìn)展微生物采油技術(shù)經(jīng)過多年的礦場(chǎng)試驗(yàn)和應(yīng)用，取得了較為明顯的效果。大慶油田進(jìn)行微生物驅(qū)油微觀模擬實(shí)驗(yàn)，觀察到剩余油油滴在巖心模型中的運(yùn)動(dòng)，真實(shí)地反映了微生物驅(qū)油的動(dòng)態(tài)情況：水驅(qū)后的殘余油可以各種形狀存在于多孔介質(zhì)中，細(xì)菌注入到模型后，在恒溫過程中，細(xì)菌吸附在油水界面上并就地產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，剝落油膜，對(duì)殘余油進(jìn)行分解、乳化；進(jìn)行二次水驅(qū)時(shí)，水驅(qū)的波及范圍擴(kuò)大，殘余油以油滴的形式從大孔隙中拉出來，在隨著注入水流動(dòng)的過程中，遇到不動(dòng)的殘余油時(shí)，油滴并聚，形成油驅(qū)動(dòng)油的現(xiàn)象。充分利用現(xiàn)代科技技術(shù)，有望解決目前微生物采油工程中存在的問題。其主要原因是微生物個(gè)體的大小與巖心的平均喉道半徑不匹配,平均喉道半徑越小,滲流阻力越大,導(dǎo)致微生物的運(yùn)移能力下降。其采油機(jī)理為:一是改變?cè)徒M成,二是改善驅(qū)油環(huán)境,最終使原油流向井底,提高采收率。楊鵬, 黃立信，俞　理，低滲透油藏微生物運(yùn)移能力研究，油氣地質(zhì)與采收率,油氣地質(zhì)與采收率,2006,13(2):8587作者簡(jiǎn)介:楊鵬,男, 2003年畢業(yè)于石油大學(xué)(北京)石油工程專業(yè),現(xiàn)為中國(guó)科學(xué)院滲流流體力學(xué)研究所流體力學(xué)專業(yè)在讀碩士研究生,從事微生物采油技術(shù)研究。將篩選的微生物注入到低滲透率的巖心中,從微生物驅(qū)油效率、注入壓力和微生物通過巖心的菌液濃度變化等方面研究了微生物的運(yùn)移能力,并對(duì)通過恒速壓汞技術(shù)測(cè)出的巖心孔喉半徑與微生物個(gè)體大小的匹配關(guān)系進(jìn)行了分析。然而，在理論研究上，對(duì)微生物采油技術(shù)仍有爭(zhēng)議，其礦場(chǎng)試驗(yàn)的結(jié)果是由微生物的作用還是由油井管理而獲得的，目前尚有爭(zhēng)議。憑借這些新工具，可以進(jìn)一步弄清微生物在不同地層條件油藏（或模擬實(shí)驗(yàn)）中具體的生長(zhǎng)、代謝活動(dòng)和運(yùn)移情況，對(duì)微生物驅(qū)油機(jī)理的研究提供了有利幫助。2000年底， 勝利油田東辛采油廠引進(jìn)了美國(guó)NPC公司的耐高溫菌種，在y16井組開展了高溫油藏微生物驅(qū)油提高采收率研究和礦場(chǎng)試驗(yàn)，以期解決同類油藏微生物采油的技術(shù)問題。19901993年，在Phoenix油田運(yùn)行了第二輪試驗(yàn)，%，驗(yàn)證了微生物采油的可行性。微生物采油就是利用微生物代謝產(chǎn)生的聚合物、表面活性劑、二氧化碳及有機(jī)溶劑等進(jìn)行驅(qū)油。在國(guó)內(nèi)外，微生物采油技術(shù)的先導(dǎo)性礦場(chǎng)試驗(yàn)已初見成效，較為典型的數(shù)美國(guó)和俄羅斯，我國(guó)的吉林、勝利等油田也進(jìn)行了礦場(chǎng)試驗(yàn)，增油效果鼓舞人心。7H2O g, FeSO4痕量, 蒸餾水1 L, pH 。 培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基: g, 蛋白胨10 g, NaCl 15 g,蒸餾水1 L, pH 。隨著我國(guó)油氣田的不斷開發(fā)和環(huán)境保護(hù)法規(guī)的日益完善, 要求必須處理的鉆井廢水會(huì)不斷增多〔3, 4〕。油氣田開發(fā)工程作為資源開發(fā)型建設(shè)項(xiàng)目, 在為人類提供能源的同時(shí), 會(huì)產(chǎn)生大量的鉆井廢水, 給生態(tài)環(huán)境帶來影響。向廷生,汪保衛(wèi),油田地表土壤甲烷氧化菌的分離鑒定及活性測(cè)定,石油天然氣學(xué)報(bào)(江漢石油學(xué)院學(xué)報(bào)), 2005,27(2):324328[作者簡(jiǎn)介] 向廷生(1963 ) , 男, 1989年大學(xué)畢業(yè), 碩士, 副教授, 主要從事石油地質(zhì)微生物方面的研究。3) 篩分出的兩株MOB中有一株菌落顏色呈青色, 類似于霉菌菌落, 但顯微鏡觀察卻發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞形體很大且不能被革蘭氏染色法染色。由于發(fā)生于細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)都離不開水的參與, 濕度的降低對(duì)細(xì)胞的最直接影響是外源無機(jī)鹽無法通過正常途徑為細(xì)胞所吸收。4) 固體斜面純化培養(yǎng)的菌落形態(tài)觀察　經(jīng)過固體斜面純化培養(yǎng)分離出兩株MOB, 形態(tài)特征為:①青色菌落, 類似于霉菌, 橢圓形, 個(gè)體很大, 100倍油鏡可見細(xì)胞核及處于雙核狀態(tài)的細(xì)胞。3) 固體10倍稀釋滾管分離培養(yǎng)物形態(tài)觀察　液態(tài)培養(yǎng)D及固態(tài)培養(yǎng)A, B, C的土樣懸液經(jīng)10倍稀釋法滾管分離培養(yǎng), 在1025, 1026, 1027三個(gè)稀釋度均有菌落出現(xiàn)。 ③C1 土樣懸液, 放大40倍為球狀, 放大100倍為短桿狀。觀察到血清瓶?jī)?nèi)液體培養(yǎng)物底部土樣上表面有一些白色衣帶狀薄層, 可能是表面菌膜沉積下來而形成的。3) MOB的純化　采用液體10倍稀釋分離培養(yǎng)與固體10倍稀釋滾管分離相結(jié)合的方法進(jìn)行分離,采用固體斜面純化分離培養(yǎng)物。下面研究油田地表土壤甲烷氧化菌的分離鑒定及活性測(cè)定。 而在非輕烴環(huán)境中生長(zhǎng)的微生物在C2 ～C5 為碳源的培養(yǎng)基中需要一段適應(yīng)期, 生長(zhǎng)緩慢。已知微生物首先通過甲烷加氧酶活化甲烷, 在有氧條件下生成甲醇, 進(jìn)一步氧化可生成甲醛。它僅能利用C1 化合物, 而不能利用糖類或其他有機(jī)物, 具有高度的專一性。在地層壓力的驅(qū)動(dòng)下, 油氣藏的輕烴氣體持續(xù)地向地表作垂直擴(kuò)散和運(yùn)移。因此研究新的微生物分離方法已成為微生物勘探技術(shù)推廣應(yīng)用的必然。佘躍惠,何正國(guó),楊柳岸等，油砂山油田本源微生物分子生物學(xué)初步調(diào)查，大慶石油地質(zhì)與開發(fā)，2005,24(5)：8284[摘要] 在地層壓力的驅(qū)動(dòng)下, 油氣藏的輕烴氣體持續(xù)地向地表作垂直擴(kuò)散和運(yùn)移。根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果, 克隆株菌均與數(shù)據(jù)庫(kù)中同一屬的細(xì)菌具有大于90%的同源性, 除了菌株CY3外,其余的菌株與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌中的同源性均不超過98% , 但是一般認(rèn)為16S rRNA序列同源性小于98%時(shí)屬于相同屬而不同種, 同源性小于93% ～95%時(shí)屬于不同屬?！悠坊蚪M16S rDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增及純化使用基因組16S rDNA全長(zhǎng)通用引物擴(kuò)增純菌基因組16S rDNA 全長(zhǎng), PCR 擴(kuò)增體系和程序見文獻(xiàn)[ 3, 4 ] 。將濾膜取出剪成碎片裝入10 mL的離心管中, 加入360 μL 新鮮的溶菌酶溶液37 ℃溫育1h后加入115 μL SDS ( 10% ) 溶液和25μl蛋白酶K (20 mg/mL) 溫育2 h, 加入400μL的5M NaCl上下顛倒混勻后在其中加入預(yù)熱到65 ℃的280μL CTAB溶液, 65 ℃溫育20 min。1　材料與方法　材料(1) 樣品取自青海油砂山油田油井井口油、水樣?！　?gòu)建16S rDNA克隆文庫(kù)是微生物分子生態(tài)學(xué)中用來調(diào)查環(huán)境中原核微生物組成的常用方法之一。湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2002A04010)作者簡(jiǎn)介:向廷生(1963 ) ,男,碩士,副教授,從事石油地質(zhì)微生物方面的研究,E mail :xiangtingshengsina. 。因此,在微生物純培養(yǎng)的基礎(chǔ)上來研究微生物提高原油采收率機(jī)理,并以此來指導(dǎo)微生物的現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)還存在很大的不足。認(rèn)為是一株新種:地下棲熱袍菌( T. subterranea) 。而B .licheniformis TRC 18 2 a 不在所分離的油藏樣品中。FujiwaraK, et al . [28 ] 利用限制性片斷長(zhǎng)度多樣性(RFLP) 分析了向油藏注入的2 種微生物( E. cloacae TRC 322 及B . licheniformis TRC 18 2 a) 的16S rRNA 基因,來監(jiān)測(cè)微生物在地層的繁殖和運(yùn)移情況。從生產(chǎn)流體中全部菌落的DNA 構(gòu)建了2 個(gè)16S rRNA 基因文庫(kù),使用古細(xì)菌或通用寡核苷酸引物。3 　最新研究進(jìn)展3. 1 　用分子生物技術(shù)對(duì)油藏中的微生物進(jìn)行分類鑒定隨著分子生物學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育分析方法的發(fā)展,人們運(yùn)用基于16r RNA(rDNA) 基因的分子生物學(xué)來分析復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)。這種菌具有耐高溫、耐鹽的特性,還可以降解原油中的飽和烴、芳烴和膠質(zhì)瀝青質(zhì),代謝產(chǎn)物可以是生物表面活性劑、氣體、酸等。3) 能夠與地層本源菌配伍。針對(duì)油藏特點(diǎn),采油微生物還需具備如下特點(diǎn):1) 能夠在油藏條件下旺盛地生長(zhǎng)繁殖。據(jù)報(bào)道[21 ] ,90 年代俄羅斯的本源微生物驅(qū)油技術(shù)在多個(gè)油田應(yīng)用,累計(jì)增油35 萬噸,效果顯著。研究中發(fā)現(xiàn)碳酸鹽巖儲(chǔ)層能為發(fā)酵提供緩仲作用,它能中和細(xì)菌產(chǎn)生的酸,增加二氧化碳的產(chǎn)量,原油的采收率隨著碳酸鹽含量的增加而增加,但當(dāng)碳酸鹽含量超過20 %時(shí),原油的采收率不再增加。通過驅(qū)替實(shí)驗(yàn)研究了營(yíng)養(yǎng)物的濃度、培養(yǎng)溫度和碳酸鹽含量對(duì)水驅(qū)殘余油采收率的影響。菲利浦石油公司在激活和保持本源微生物活性方面申請(qǐng)了多項(xiàng)專利[21 ] ,這些專利都是關(guān)于如何注入地層缺乏而微生物又需要的營(yíng)養(yǎng)成分。2 　在石油工業(yè)中的應(yīng)用2. 1 　激活本源微生物提高原油采收率本源微生物是指存在于油藏中較為穩(wěn)定的微生