細(xì)胞與分子生物學(xué)(完整版)
【正文】 DDRTPCR technique were introduced1. The usability and achieved research results by using thismethod were summarized from the aspects of rice development gene, heterosis gene and the resistance gene1 The p rospective app lication of DDRTPCR in paddy rice mutant and resistance to agricultural chemicals research was also exp lored in the paper.Keyword s: mRNA differential display Heterosis Resistance ACP 許多年以來，分離差異表達(dá)基因的方法僅限于差異篩選cDNA文庫，直到1992 年Liang等發(fā)明了一種檢測基因轉(zhuǎn)錄模式的方法，即mRNA 差異顯示技術(shù)(mRNA Differential Display Reverse TranscriptionPCR, DDRTPCR)[1]，它是將mRNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù)與PCR技術(shù)二者相互結(jié)合發(fā)展起來的一種RNA指紋圖譜技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于分離鑒定組織特異性表達(dá)的基因，差別基因表達(dá)（differential gene express）是細(xì)胞分化的基礎(chǔ)[2]。mRNA差別顯示技術(shù)正是對組織特異性表達(dá)的基因進(jìn)行分離的一種快速而行之有效的方法。許多研究者提出了各種辦法來提高引物退火的特異性，如在引物的5’端增加一段通用引物序列，或加一段同聚物，或加上一段環(huán)狀序列，以增加PCR 擴(kuò)增的特異性和退火的穩(wěn)定性，但這些方法并不能消除初始反應(yīng)的非特異性退火[7]。2 ACP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) 假陽性低假陽性高是目前克隆差異表達(dá)基因的瓶頸問題之一， ACP技術(shù)可使引物在初始反應(yīng)與模板鏈特異結(jié)合，擴(kuò)增出真實(shí)可靠的產(chǎn)物，從而降低了PCR 結(jié)果的假陽性。操作步驟1．總RNA的提?。ㄒ奛orthern 雜交）2．第一鏈合成：(1)總RNA樣品 2μg；cDNA合成引物 1μl；加ddH2O補(bǔ)至5μl。(8)將2μl反應(yīng)液分別轉(zhuǎn)至新管中（新管標(biāo)號(hào)為1B,2B,PC B等）。 9600 擴(kuò)增儀上執(zhí)行以下程序：94℃ 5min 1 cycles 40℃ 5min 68℃ 5min 94℃ 30sec 2 cycles 40℃ 30sec 68℃ 5min 94℃ 20sec 23 cycles 40℃ 30sec 68℃ 2min
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