電泳技術(shù)及其在分子生物學(xué)中的應(yīng)用(完整版)
【正文】 Western blotting 印跡法（ blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種方法。 倒掉二抗溶液，用 PBST (或 TBST)漂洗液濾膜 3次，每次 10min。 1）蛋白提取 2） SDSPAGE 3）轉(zhuǎn)膜 4）封閉 5）一抗作用 6）標(biāo)記二抗作用 7）結(jié)果檢測(cè) Western blotting 基本步驟： 轉(zhuǎn)膜 將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤(rùn)濾紙之間。 因此 ， 蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物在 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中的遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響 ， 而主要取決于橢圓棒的長(zhǎng)軸長(zhǎng)度 ， 即蛋白質(zhì)亞基分子量的大小 。一四甲基乙二胺 )和 過(guò)硫酸銨的作用下，丙烯酰胺聚合形成長(zhǎng)鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑， N， N39。 可用于檢測(cè)單鏈或雙鏈核酸（ DNA和 RNA）。 緩沖液系統(tǒng) 常用的電泳緩沖液有 EDTA（ ）和 Tris乙酸（ TAE）， Tris硼酸（ TBE）或 Tris磷酸（ TPE）等，濃度約為 50mmol/L(~)。 ? 凈電荷： 生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等常以顆粒形式分散在溶液中，它們的 凈電荷 取決于介質(zhì)的 H+濃度與其他大分子的相互作用。其結(jié)構(gòu)單元是 D半乳糖和 L半乳糖。 cm ：電場(chǎng)正負(fù)極間的距離。 ? 凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠 。 限制性片段多態(tài)性 (RFLP) 點(diǎn)多態(tài)性實(shí)驗(yàn)方法 SDS聚丙烯酰胺凝膠 電泳 （ SDSPAGE） 的原理 在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn) SDS（十二烷基磺酸鈉）， SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)，在強(qiáng)還原劑（ beta巰基乙醇）作用下，使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂。 1975年， Southern建立了將 DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（ NC膜）上，并利用 DNA－ RNA雜交檢測(cè)特定的 DNA片段的方法，稱為 Southern印跡法。 結(jié)果檢測(cè) : 二抗與底物反應(yīng)顯色 ?辣根過(guò)氧化物酶法（ HRP） ?堿性磷酸酶法（ AP） 第一部
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