電泳技術(shù)及其在分子生物學(xué)中的應(yīng)用(文件)
【正文】 SDS聚丙烯酰胺凝膠 電泳 （ SDSPAGE） 的原理 在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn) SDS（十二烷基磺酸鈉）， SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，同時，在強(qiáng)還原劑（ beta巰基乙醇）作用下，使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子量在 15KD到 200KD之間時 ， 電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系 。 1975年， Southern建立了將 DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（ NC膜）上，并利用 DNA－ RNA雜交檢測特定的 DNA片段的方法，稱為 Southern印跡法。 正極 三層濾紙 硝酸纖維素濾膜 凝膠 三層濾紙 負(fù)級 轉(zhuǎn)膜后檢測 麗春紅 S染色 預(yù)染蛋白 marker 考馬斯亮藍(lán)染色 封閉 : 膜上的空白位點(diǎn) 脫脂奶粉（ 5％） BSA(牛血清白蛋白 ) 一抗、標(biāo)記二抗孵育 把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以 與濾膜溫育， 4 ℃ 過夜。 結(jié)果檢測 : 二抗與底物反應(yīng)顯色 ?辣根過氧化物酶法（ HRP） ?堿性磷酸酶法（ AP） 第一部分完 。 加入二抗溶液，搖床上緩慢搖動， 37℃ 2 小時。 對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法 . Western Blotting 基本原理 在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDSPAGE） 負(fù)極 積層膠 分離膠 加樣孔 正極 配置 積層膠 分離膠 丙烯酰胺濃度 5% 1015% TrisHCl 1M， PH= ， PH= SDS，過硫酸銨， TEMED濃度相同 電泳 積層膠 分離膠 電壓 80V 120V TrisHCl 甘氨酸電泳
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