【正文】 在其分子兩端各含有12個堿基的互補單鏈，是天然的粘性末端，被稱為COS位點 。 二、載體的分類 * （一） 克隆載體 用來克隆和擴增 DNA片段的載體。 六、末端 （脫氧核苷酸）轉(zhuǎn)移酶 (TdT) 作用 將標記或未標記的 dNTP加到 DNA的 3ˊ — OH末端；也可催化載體分子或待克隆的 DNA片段上加上互補的同聚尾 ， 便于進一步連接 。 逆轉(zhuǎn)錄酶的應用： ⑴ 將 mRNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，構(gòu)建 cDNA文庫 ； ⑵ 補平和標記 5ˊ 末端突出的 DNA片段； ⑶ 代替 Klenow酶用于 DNA序列分析； ⑷ 制備雜交探針等。539。539。 539。 539。 二、 DNA聚合酶 （ 最常用的 DNA聚合酶有以下 4種 ） DNA聚合酶 Ⅰ （全酶） DNA聚合酶 Ⅰ 大片段 —— Klenow片段 Taq DNA聚合酶 T4 噬菌體 DNA聚合酶 ㈠ DNA聚合酶 Ⅰ DNA聚合酶 Ⅰ （ DNA pol Ⅰ ） 是一個具有 3 種酶活性的多功能性酶。 TT 3 39。 3 39。339。C C A T GG T A C C 3 39。 A AAAAA339。 C C C3 39。339。 粘性末端 (sticky end) 是指經(jīng)內(nèi)切酶特異切割后產(chǎn)生的 5ˊ －末端突出和3ˊ －末端突出的堿基序列相互間具有互補性 。第十七章 基因重組與基因工程 (geic rebination and geic engineer) 基因重組 (geic rebination) 是指在體外用酶學方法將不同來源的 DNA進行切割、連接，組成一個新的 DNA分子的過程，又稱 DNA重組 。 ⑴ 產(chǎn)生 539。G A C G T C +P s t I339。 G G GG G G 3 39。T T T 5 39。G 5 39。539。 5 39。A 5 39。 包括： 5ˊ →3 ˊDNA 聚合酶活性 5ˊ →3 ˊ 核酸外切酶活性 3ˊ →5 ˊ 核酸外切酶活性 DNA pol Ⅰ 應用 ⑴ 常用來 催化 DNA缺口平移反應，制備高比活性 DNA 探針 ； ⑵ cDNA第二條鏈的合成； ⑶ 對 DNA3?突出末端進行標記； ⑷ DNA序列分析。 339。 339。339。539。 四、 DNA連接酶 (DNA ligase) 催化雙鏈 DNA中一條鏈的 3ˊ － OH與另一條鏈的5ˊ － PO3H2形成磷酸二酯鍵 ， 從而構(gòu)成完整的 DNA長鏈 。 應用 ① 探針標記 G32G32G32G32 G32G32G32G32 ② 在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾 ， 以便于進行連接 3180。 有質(zhì)粒 DNA、噬菌體 DNA和病毒 DNA三類 。 λ噬菌體兩種生長途徑（示意圖） λ 噬菌體感染細菌后的 兩種生長途徑 溶菌性生長 噬菌體感染細菌后 ， 借助其 2個 COS位點互補 成環(huán) ， 在宿主菌體內(nèi) 連續(xù)復制 ， 合成大量基因產(chǎn)物 ， 進而裝配成噬菌體顆粒 ， 裂解宿主菌 ， 釋放出來的噬菌體又可感染其他細菌 。 （ 一般先合成短片斷 DNA，然后再拼接成長片段 ） 二、 目的基因與載體的連接（ 接 ） （主要有以下 4種連接方式） 1) 粘性末端連接 2） 平頭末端連接 3） 人工接頭法 4） 同源多聚尾連接法 （一） 粘性末端連接 將目的基因和載體用同一種限制酶酶切，產(chǎn)生 相同粘性末端，再通過 DNA連接酶作用將兩者連接起來，構(gòu)成重組 DNA分子。 四、重組 DNA的篩選與鑒定（ 篩 ） （ 篩選含重組體的陽性菌落，一般有下列幾種方法 ） 1） 平板篩選 2） 限制酶切圖譜篩選 3） PCR篩選重組體 4） 原位雜交技術(shù) 插入失活 藍－白篩選 （一） 平板篩選 是指利用載體的遺傳性標記在平板上直接篩選的方法。 ⑵ 基因轉(zhuǎn)錄要有啟動子，而啟動子必須能被宿主 細胞的 RNA聚合酶有效地識別 。 如 ， （ 1） 乙型肝炎病毒疫苗（ HBV）、丙型肝炎病毒疫 苗（ HCV）等； （ 2） 有誘發(fā)致癌或產(chǎn)生免疫病理作用的疫苗，如人 T細胞免疫缺陷病毒（ HITV1）等； （ 3） 常規(guī)效果較差的疫苗，如霍亂和痢疾疫苗等 （ 4） 制備一些多價疫苗等。聚合酶活性 B. 5180。外切酶活性 D. 5180。聚合酶活性 4. 堿性磷酸酶的作用是 A. 使核酸片段 3180。端磷酸基 C. 去除核酸片段的 5180。 和 3180。 和 3180。 1. 分離體細胞 （ 先處于 “ 饑餓 ”的 “ 靜止狀態(tài) ” ） → 使 “ 關(guān)閉 ” 的基 因 全 部 “ 打開 ” 。 第四節(jié) 重組技術(shù)在醫(yī)學和制藥工業(yè)中的應用 一、疾病基因的發(fā)現(xiàn) 1990年 美國科學家率先啟動 人類基因組計劃（ HGP）， 計劃歷時 15年，至 2022年完成；