【正文】 A探針利用 Klenow片斷進行 3’端標記5’末端突出的DNA（ 2） Taq 反（逆）轉錄酶167。 如： EcoRI restriction endonuclease和 EcoRI methylaserestriction改建質粒3′AGCOHI為例：3′G5′GPorend) 第四字母（大寫，斜體），示該酶微生物 株或型 ；216。coli,定義 ：是一類能識別和切割雙鏈 DNA分子中特定堿基序列的核酸水解酶。線性雙鏈 DNA末端標記，合成 cDNA的第二鏈transferase)(polynucleotide(DNA 疾病診治二、重組 DNA技術的原理及過程基本過程： 分切接轉篩（一）工具酶又稱基因工程（ genecloning）、重組 DNAcloningshuffling轉座序列結構反向重復序列反向重復序列轉座酶基因IS轉座酶基因 ampR 反向重復序列Tn3轉座酶基因 tetRTn10IS細菌中的三種轉座子類型插入序列的復制性轉座轉座子 (transposons)repests）列和側翼二個正向重復序列（ direct)轉座 :167。7(rebinationpattern.arrangedchains.geneselementstherearrangedshownrearrangedcellsmouseJ POB180。IHF:repeat,3180。3180。切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側來自同一親本DNA。3180。3180。3180。3180。3180。3180。coli 3180。5180。3180。3180。5180。5180。分支遷移5180。(B)bound216。216。表達。菌感 具有攝取周圍介質中游離 DNAcell） :轉化 (tranformation)重組 DNA技術 ?216。在分子水平上進行遺傳操作， 按設計的藍圖 ，從供體中提取或人工合成 目的基因，使其與載體構建成重組 DNA，再轉移到受體細胞。rebinationengineering中心法則 逆 轉錄轉錄 RNA翻譯 蛋白質復制 DNA生物體 環(huán)境 基因的表達調控 rebination）轉座重組 （ transposition的 DNA,而獲得新的遺傳表型。分子能力的細菌細胞。cI同源重組發(fā)生在任何生物中。Hollidayaaa3180。 3180。內切酶3180。 3180。DNA5180。5180。5180。3180。5180。5180。5180。rebinant)3180。5180。λ噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點發(fā)生選擇性整合；216。site,excisionasePOP180。216。h1H2與阻遏基因 mRNAHin重組酶 H2鞭毛素 阻遏蛋白(a)h1hinJTheanizationleft,Bthesinglegenebelowgenesplementaryto加入復合物，切割七核苷酸序列位點等 RSS)。(（一）有關 DNA克隆的相關概念克隆（ clone） :又稱 分子克隆 重組 DNA技術 (rebinant 縮短進化時間；167。(restrictionpolymerase堿性磷酸酶 切口平移反應，制備高比活探針； 催化將把一個磷酸分子加到多核苷酸鏈的 、甲基化vIII， EcoR II， EcoR V216。216。I為例：OHG3′ACGTC5′產(chǎn)生平末端（ bluntCGA3′DNA雜交與序列分析 大腸桿菌 DNA聚合酶 Ⅰ 及其大片斷（ Klenow片段）167。5′→3′ 外切酶活性主要用途 :1988年 saiki在嗜熱水生菌 (thermus3′→5′ 外切酶活性（又稱 RNA酶 H活性），特異性降解 RNADNA雜交分子中的 RNA部分（ 4）末端脫氧核糖核酸轉移酶（末端轉移酶 , terminal transferase）催化作用： 在二價陽離子存在下，它催化 dNTP加到 DNA分子的 3′羥基端。載體特征：l 自主復制 即有復制原點（必需）l 酶切位點（必需）l 大小適合l 篩選標記 : 如抗藥性、營養(yǎng)標記、 ?半乳糖苷酶顯色反應等l 拷貝數(shù)高 載體類型 ：l 來源 : 質粒；噬菌體；病毒 , 酵母人工染色體l 功能 : 克隆載型體和表達型載體l 受體細胞 : 原核細胞載體、真核細胞載體和穿梭載體（ shuttle vector）u質粒（ plasmid） ： 細菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀 DNA。；Ampr；藍白斑篩選（ lacZ39。vector）：外源性 DNA直接插入酶切位點（ EcoRⅠ ）? 容量：幾個 kb? 代表載體： λgt10； 這種保存在宿主細胞內的 cDNA集合體稱 ~。I導入方法u氯化鈣法制備條件： 冰浴、低滲 CaCl2?互補原理篩選（蘭白斑篩選）重組子 pUC18amprampr藍白斑篩選重組質粒原位雜交Radioactive probe will hybridize with its plementary DNAWash filter, prepare autoradiograph and pare with master platePlace nitrocellulose filter in sealable plastic bag with solution of labeled DNA probeSouthernDNA載體消化： ?噬菌體 DNA用Bamoverlappinggenomicthesinglestranded5’regionrecognitionPartialyieldkbtheDNASau3Alibrary從文庫中篩選目的基因 外源基因在載體上表達必須具備： 強的啟動子 核糖體結合位點 翻譯起始和終止位點（七）克隆基因的表達原核表達體系 大腸桿菌、枯草桿菌表達系統(tǒng) 優(yōu)點： 方法簡單、迅速、經(jīng)濟，適合大規(guī) 模生產(chǎn)。1b,transgenicgenesizeDorset種白綿羊　　線粒體母親：一只蘇格蘭黑臉羊　　生育母親：另一只蘇格蘭黑臉羊　　進入社交圈時間： 1997年 2月 23日　　子女：生育 6名，存活 5名　　死亡： 2023年 2月 14日動物克隆動物克隆技術路線復習題概念： 重組 DNA技術（基因工程）、限制性核酸內切酶、粘性末端、平末端、 演講完畢，謝謝觀看！。aThiswith?品 功 酵母、昆蟲、哺乳動物細胞表達系統(tǒng) 優(yōu)點： 能轉錄后加工，即能剪接內含子； 能翻譯后加工，即能糖基化修飾等； 通常不形成包涵體，能正確折疊。文庫構建PreparationsitesHumanbethatUsevarietyof(red)humanendendssequencewithfragments基因組片段與 ?噬菌體 DNA拼接成重組 DNA167。aofIIIvector）：外源性 DNA替代載體中央部分? 酶切位點： EcoRⅠ