【正文】 關(guān)閉狀態(tài)，但當(dāng)加入乳糖或者半乳糖苷結(jié)構(gòu)類似物，如異丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）、硫甲基半乳糖苷（ TMG）和鄰硝基苯基半乳糖苷（ ONTG）后可發(fā)生脫阻遏作用。 (2) 由于使宿主細(xì)胞處于生長的逆境，容易發(fā)生載體 質(zhì)粒的丟失； (3) 非調(diào)控性地表達(dá)外源蛋白，容易受到蛋白酶的水 解作用，從而使最終的蛋白量并不高； (4) 形成不溶性的包含體蛋白。 核心酶（ ?2ββ’）： 轉(zhuǎn)錄功能單位 全酶（ ?2 ??’?） （ core enzyme） （ holoenzyme） σ因子 ：參與識(shí)別特異的啟動(dòng)子 原核生物 RNA聚合酶能被 利福平（ rifampicin）所抑制 。 7) 上游（ Upstream） 。 3) RNA聚合酶（ RNA polymerase） 。 利福平與 β 亞基相結(jié)合，從而抑制酶的活性。 （一）可調(diào)控啟動(dòng)子 (Regulatable Promoters)： 大腸桿菌中已開發(fā) 5種可調(diào)控啟動(dòng)子 (1) Plac 啟動(dòng)子：即 E. coli lac啟動(dòng)子 。 乳糖操縱子基因產(chǎn)物 : 1) lacI: 阻遏蛋白 。 （ 1）由 trpR產(chǎn)生的阻遏蛋白只有在與色氨酸結(jié)合后才能形成有活性的阻遏蛋白，它可以與操縱基因結(jié)合從而阻止轉(zhuǎn)錄的起始。 mRNA與核糖體的結(jié)合能力： （ 1） RBS與翻譯起始密碼子（ AUG）之間的距離要合適； （ 2）編碼從結(jié)合位點(diǎn)到起始幾個(gè)密碼子之間的的 DNA序 列不應(yīng)含有可能形成 環(huán)狀結(jié)構(gòu) 的序列，否則會(huì)妨礙 與核糖體的結(jié)合。 如： pDR720 質(zhì)粒 pDR720是一個(gè)含 trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體，它來源于 p51， trp啟動(dòng)子在 Sma I位點(diǎn)插入，在啟動(dòng)子的下游有 3個(gè)位點(diǎn)， Sal I、 BamH I和 Sma I，可以插入外源基因。 （ 1）來源于 pBR322, pBR322的 EcoRI/BamHI位點(diǎn) 被 PL 和 N基因取代； （ 2）外源基因可以插入到 N基因中的 HpaI位點(diǎn)； （ 3）當(dāng)培養(yǎng)溫度為 2931?C時(shí)， PL啟動(dòng)子處于阻遏 狀態(tài)；但當(dāng)溫度升到 42?C，發(fā)生脫阻遏。 ?半乳糖苷酶在不同受體菌中的表達(dá)： 攜帶包含大腸桿菌 lacZ 基因和異源啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體的不同革蘭氏陰性菌受體菌中測定的 ? 半乳糖苷酶活性 ? G al acto sidas e a cti vity (U) in : Promoter Escher ichia coli Rh i zobium melil oti Rh i zobium legumi no s arum Pseud omo na s pu ti d a None 16 110 130 150 Nm 1,40 0 21 , 800 13 , 900 16 , 300 lac 2,00 0 9,05 0 6,25 0 9,80 0 tac 11 , 300 2,85 0 1,15 0 2,95 0 S1 40 3,30 0 1,20 0 3,35 0 苜蓿根瘤菌 豌豆根瘤菌 惡臭假單胞菌 大腸桿菌 ?半乳糖苷酶在不同受體菌中的表達(dá)分析： (1) 所有啟動(dòng)子在受體菌中都有一定的活性； (2) tac啟動(dòng)子在大腸桿菌中活性最高，但是在其它受體菌中活性最低； (3) 新霉素基因啟動(dòng)子（ Nm）是在大腸桿菌中活性最低的啟動(dòng)子，但是在其它受體菌中驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的活性卻最高。 不利方面： 容易受到受體菌蛋白酶的降解，產(chǎn)量較低。 融合蛋白的表達(dá) 1. “三夾板”式融合 2. 3. C末端融合 N末端融合 運(yùn)載蛋白 運(yùn)載蛋白 異源功能蛋白 運(yùn)載蛋白 運(yùn)載蛋白 異源功能蛋白 異源功能蛋白 通過在細(xì)胞膜跨膜蛋白中“鑲嵌”外源蛋白，是一種典型的 “三夾板”式融合方式 pPC?系列載體： pPC???Z1， pPC???Z2和 pPC???Z3。 （八）單一方向串連排列的基因 在低拷貝質(zhì)粒中表達(dá)多個(gè)串連排列的基因，以增加蛋白的表達(dá)量。 （ 3）在可能的情況下，改變蛋白質(zhì)中的 “ PEST”序列，但這種改變不能影響蛋白質(zhì)的功能。 在大腸桿菌中所表達(dá)的外援蛋白大部分都是以包含體的形式存在。加入的洗滌液可以通過柱層析等方法除去。 鹽酸胍的溶解效率很高，可以達(dá)到 95％以上，且溶解速度快，因而不會(huì)對外源蛋白進(jìn)行共價(jià)修飾。 一般等電點(diǎn)處于極端位置（ pI5或 pI8）的基因工程蛋白質(zhì)應(yīng)首選離子交換層析方法； （ 3） 不同蛋白質(zhì)可以選用不同的特異性親和配基。 多種分離純化技術(shù)的綜合運(yùn)用 （ 1）應(yīng)選擇不同分離純化機(jī)理的方法共同使用； （ 2）應(yīng)首先設(shè)法除去含量最多的雜質(zhì)； （ 3）要盡量采用高效分離方法； （ 4）要把最費(fèi)時(shí)、成本最高的分離方法安排在最后的階段 選擇合適的分離純化材料 要求： （ 1） 有較高的分離效率； （ 2）在分離純化過程中不會(huì)造成目的蛋白的變性； （ 3）化學(xué)和機(jī)械性能穩(wěn)定，重復(fù)性好； （ 4）成本較低 分離純化過程的規(guī)模化 規(guī)?；梢越档统杀?。 一般變性時(shí)要考慮以下幾方面的因素： ① 變性劑的濃度及變化率； ② 外源蛋白的濃度及其純度； ③ 氧化還原劑的選擇； ④ pH值的選擇； ⑤ 適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度； ⑥ 合適的溫度和作用時(shí)間； ⑦ 分子伴侶的作用（ chaperone） （二）表達(dá)蛋白純化的基本原則 針對不同的產(chǎn)物表達(dá)形式采取不同的策略； （ 1）對于體積大、濃度低的分泌蛋白體系，先通常先要進(jìn)行濃縮處理， 如沉淀、超濾； （ 2）可溶性表達(dá)產(chǎn)物先用親和層析法進(jìn)行純化； （ 3）對于在壁膜間隙中表達(dá)的蛋白介于分泌性蛋白和細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白兩者之間，可以先用 低濃度溶菌酶 處理，再用滲透壓休克法進(jìn)行純化； 針對不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)選用不同的層析類型 （ 1） 用離子交換層析分離具有不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)。 ① SDS：是曾經(jīng)廣泛使用的溶解劑，可以在低濃度（ 1％）下使包含體溶解。