【正文】 點 (Startsite)。 啟動子： DNA分子中與 RNA pol I發(fā)生特定結合的序列，啟動轉錄過程。 四種簡單類型控制通路 誘導作用是指存在誘導物能使阻遏蛋白失活，或者可激活一個激活蛋白而解除阻遏蛋白對轉錄起始過程的阻遏； 阻遏作用是指一個輔阻遏物激活一種阻遏蛋白，或者使一種激活蛋白失活而對轉錄過程發(fā)生阻遏作用。 Glucose reduces CRP activiy CRP復合物形成促進RNA聚合酶與啟動子的結合 當 CAP與 cAMP協(xié)同作用時，其對啟動子的親和性發(fā)生增強，而此時如果葡萄糖的量達到最低時，其親和性最高。 Ptac 啟動子 ： 是來自于 lac和 trp的一組雜合啟動子，但是比 lac和 trp都強得多，是一組強啟動子。其最大的特點是帶有編碼 lacZ（ ?半乳糖苷酶 ）的編碼序列。如： pKK2233。 電泳后回收片段 c 電泳后回收片段 1和 3 連接 由于 pKN402和 pCP3的復制子在 42?C時仍然具有很強的起始復制能力，因此當培養(yǎng)溫度升高到 42?C時，細胞中的pKN402和 pCP3的拷貝數要比 pPLc2833高 5～ 10倍。 廣 宿 主 載 體 （六）非融合蛋白的表達 指所表達的外源蛋白的 N末端不含有其它任何氨基酸，因此要求其翻譯起始位點 ATG必須要位于其基因的 5’端。 Ion為 E. coli合成蛋白酶的主要底物。 pPC???Z2的 EcoRI位點之 前多了 2個 G，經 EcoRI酶切 后的為 GGG； pPC???Z3的 EcoRI位點之 前多了 4個 G，經 EcoRI酶切 后的為 GGGGG。 正常情況下蛋白質的半衰期：從 幾分鐘 到 幾小時 不等。 外源基因的整合途徑： （ 1） 轉座作用 （包括插入序列）； （ 2） 同源交換 。常用洗滌液： ① 1%以下的中性去垢劑，如 Tween、 Triton、 NP40等； ② 可以在中性去垢劑中再添加 EDTA和 二硫蘇糖醇（ DTT）、巰基乙醇 等還原劑，并保持 NaCl的濃度為 50 mM； ③ 低濃度 鹽酸胍 或 中性去垢劑、 EDTA及 還原劑 共同使用。但是結合到外源蛋白上的 SDS分子 很難除去 ，這種蛋白作為藥物使用的話，可能會造成流產；同時少量氧化物的存在會造成外源蛋白的共價修飾，因此目前很多國家的政府機構，已經禁止用 SDS溶解的蛋白產品上市。 通常選擇各蛋白質的滴定曲線沒有交叉的 pH值作為緩沖液的 pH值，同時還應考慮該蛋白質在該 pH值下的穩(wěn)定性和溶解性； （ 2） 用離子交換層析分離等電點相同但表面電荷分布不同的蛋白質。 （三）表達蛋白的 PEG化 對表達的蛋白質進行聚乙二醇（ polyethylene glycol, PEG）修飾，以達到降低免疫原性，延長半衰期，保持藥效活性的目的。 通常選擇各蛋白質的滴定曲線沒有交叉的 pH值作為緩沖液的 pH值，同時還應考慮該蛋白質在該 pH值下的穩(wěn)定性和溶解性； （ 2） 用離子交換層析分離等電點相同但表面電荷分布不同的蛋白質。目前，尿素已被廣泛用于包含體的溶解。常用洗滌液： ① 1%以下的中性去垢劑，如 Tween、 Triton、 NP40等； ② 可以在中性去垢劑中再添加 EDTA和 二硫蘇糖醇（ DTT）、巰基乙醇 等還原劑，并保持 NaCl的濃度為 50 mM； ③ 低濃度 鹽酸胍 或 中性去垢劑、 EDTA及 還原劑 共同使用。 （一）包含體蛋白的提取 包含體蛋白： Inclusion body 在大腸桿菌中當外源蛋白的表達量達到 20％時，由于表達部位的低電勢和外源蛋白分子的特殊結構（如富含 Cys、無糖基化等），使外源蛋白與其周圍的其它雜蛋白及其核酸一起形成的一種不溶性的結構。如：在 ?半乳糖苷酶的 N端加上不同的氨基酸，體外存活的時間可以從 2分鐘到 20小時不等。 現(xiàn)已開發(fā)大量的表達融合蛋白的商業(yè)性載體： 如 Invitrogen公司： 細菌表達系統(tǒng)： pBADHis系列、 pTrcHis系列等， 酵母菌表達系統(tǒng)： 、 pPIC9K等多種 。 （七）融合蛋白的表達及純化 指所表達的外源蛋白與一種宿主蛋白共價連接，構成融合蛋白。 表達非融合蛋白的優(yōu)勢： 單基因產物，不受其它蛋白質成分的干擾，有利于其展現(xiàn)完整功能和保持活性。 A 培養(yǎng)基中不存在色氨酸 B 培養(yǎng)基中不存在色氨酸 cI蛋白合成 （脫阻遏） 無克隆基因蛋白 合成（阻遏） 克隆基 因蛋白 合成 （脫阻遏 ） cI蛋白不合成 （阻遏） （五）在其它微生物中的表達 除了 E. coli以外，有些微生物也可以用作表達外源蛋白的宿主菌（受體菌）。 含 PL 啟動子的表達載體： 是一種極強的啟動子，所以被廣泛用于各種載體的 構建； 如： pPL?。 pOP203系列表達載體： A family of cloning vectors containing the lacUV5 Promoter pOP2031,2, pOP2031 pOP2032 pOP2032 pOP2032 pOP20329 表達載體 pOP203質粒結構示意圖 含 trp 啟動子的表達載體： （ 1） 產生的表達蛋白的量高于 lac啟動子； （ 2） 所有含 trp啟動子的表達載體都受到 3?吲哚丙烯 酸（ IAA）的誘導。 ?噬菌體左向操縱子結構示意圖 PL 啟動子 (二 )、常用原核表達載體 大量產物的獲得： （ 1）強的、可調控的啟動子； （ 2） 翻譯效率； （ 3）新生肽穩(wěn)定性等。 trp 啟動子的脫阻遏可通過： （ 1）移除色氨酸； （ 2）加入色氨酸結構類似物，如吲哚丙烯酸（ 3indoleacrylic acid） . 3’?吲哚丙烯酸 色氨酸操縱子（ trp operon） 由啟動子、衰減子、操縱基因和色氨酸合成的 5種酶組成。 (3) lac 啟動子由于與阻遏蛋白相結合而處于