原核基因表達及其調(diào)控(存儲版)
【正文】 att的早期轉(zhuǎn)錄，受 到 cI所編碼的阻遏蛋白的調(diào)控。 pOP20313特點 （ 1）為 pBR322衍生質(zhì)粒，插入 了強啟動子 PlacUV5并在其下 游加入了 ?半乳糖苷酶 的 編碼序列（ ?gal） 21 bp 片斷和一個 EcoRI位點； （ 2）其融合蛋白的 N端為 ?半乳 糖苷酶的前 7個氨基酸和 EcoRI接頭編碼的少數(shù)幾個 氨基酸，其 C端為完整的外 源蛋白。 pSE420 特點： 1） Ampr； 2） tac啟動子； 3） lacZ核糖體結(jié)合部位； 4） ATG起始密碼子，位于 RBS下游 8bp處； 5）來源于 ?噬菌體的終止 子 T1和 T2，以避免其它 基因的過度轉(zhuǎn)錄。 “雙載體系統(tǒng)”特點： 1）當培養(yǎng)基中 Trp含量較低時， trp啟動子啟動， cI阻遏蛋白合成，此時 PL啟動子受阻遏，目的基因不表達； 2）添加 Trp（可添加蛋白胨）以后， trp啟動子受阻遏，而 PL啟動子啟動，此時可表達外源蛋白 。 （ 4）構(gòu)建融合蛋白。可以將 pin同時克隆到質(zhì)粒載體上。 融合蛋白的應(yīng)用 （ 1）在大多數(shù)情況下，融合蛋白本身就是很好的終產(chǎn)物，無需處理，如可以用融合蛋白來制備抗體； （ 2）由于融合蛋白的某些功能單元，可以用于簡化提純步驟。一般可以通過在 N端增加 1個或幾個氨基酸，來使蛋白質(zhì)的半衰期延長。 （ 2） C端有分泌信號的蛋白： ?溶血素（ ?hemolysin） : 可完全分泌到培養(yǎng)基中。 菌體常用破碎方法： ① 物理方法： Sonication/French Pressure ② 化學(xué)方法： Lysozyme（溶菌酶）、表面活性劑、 強堿（須考慮外源蛋白的耐受性） 洗滌目的：去除吸附在包含體表面的不溶性雜蛋白。在復(fù)性后不會造成蛋白質(zhì)的嚴重損失，同時還可以選用多種層析方法對提取到的包含體進行純化。 針對不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)選用不同的層析類型 （ 1） 用離子交換層析分離具有不同等電點的蛋白質(zhì)。 PEG化的途徑： （ 1）用氰脲酰氯、 N羥基丁二酰等活化的 PEG可以與氨基發(fā)生反應(yīng)； （ 2）用馬來酸酐和 ?氨基乙酸活化的 PEG可以與巰基進行反應(yīng)； （ 3） PEG可以與蛋白質(zhì)的羧基發(fā)生反應(yīng)。 一般等電點處于極端位置（ pI5或 pI8）的基因工程蛋白質(zhì)應(yīng)首選離子交換層析方法； （ 3） 不同蛋白質(zhì)可以選用不同的特異性親和配基。 ② 尿素和鹽酸胍 ：對包含體的氫鍵有較強的可逆變性作用。加入的洗滌液可以通過柱層析等方法除去。 A、雙交換的發(fā)生： 僅目的基因整合到染色體上 B、單交換： 整個質(zhì)粒整合到染色體上 使用 Marker可以很方便 地篩選整合重組菌株 ?淀粉酶基因整合到染色體上的拷貝數(shù)與未發(fā)生整合但由多 拷貝質(zhì)粒攜帶時表達活性的比較 （十一）外源蛋白的分泌 分泌途徑： （ 1） 分泌到周質(zhì)區(qū)（周質(zhì)空間） ； （ 2）完全分泌到細胞外的培養(yǎng)基中。決定于： （ 1） 二硫鍵 形成情況。 融合蛋白的純化 將融合蛋白分割成宿主蛋白和外源蛋白的策略： （ 1）在融合蛋白和宿主蛋白之間加入一段可被蛋白酶識別的氨基酸序列，如 IleGluGlyArg可被溶血因子 X?識別并在 C端切開，并且這一段序列在自然狀態(tài)下很少出現(xiàn)，因此可以用于分割融合蛋白； （ 2）在胰島素中沒有 Met，因此在基因工程胰島素和宿主蛋白之間可以加入一個 Met，而表達的融合蛋白的 Met在體外可以被 CNBr轉(zhuǎn)移性識別和切割，從而形成 2條多肽鏈， 1條是胰島素，另 1條是宿主多肽。 （ 3）用蛋白酶抑制劑。 表達非融合蛋白，一般要求其編碼基因的 ATG起始位點與核糖體結(jié)合位點（ RBS）之間的距離要合適，否則即使僅相差 2~3個 bp，表達效率也會大受影響。 溫度對 3種表達載體質(zhì)粒拷貝數(shù)的影響 （四）大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng) 小規(guī)模培養(yǎng)（ 1～ 5L）含表達載體的重組菌株時，其調(diào)控可以直接向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物，或者升高溫度，但是在半工業(yè)化（ 20～200L）或者工業(yè)化大規(guī)模（大于 200L）生產(chǎn)時，不能采用小規(guī)模的方法： （ 1）直接向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物如 IPTG，由于需要量較大，成本 高，不經(jīng)濟； （ 2）即使是使用溫度敏感的表達載體，升高溫度既需要較長的時 間，又需要很大的能源消耗，成本也很高。 pBADHisA, B, C。 當外源基因插入后，如果能夠保持正確的 ORF，就可以形成由外源基因編碼的多肽和 ?半乳糖苷酶組成的融合蛋白。包括： （ 1） PtacI： PlacUV5的 10區(qū) ＋ Ptrp的 35區(qū)； （ 2） PtacII： Ptrp的 35區(qū)（一段合成的包括 Pribnow框在 內(nèi)的 46bp的 DNA） ＋ Plac的操縱基因； （ 3） Ptac12： Plac的 10區(qū) ＋ Ptrp的 35區(qū) 所有 Ptac都受 IPTG的誘導(dǎo)，同時受到阻遏蛋白的阻遏調(diào)控。這樣，當誘導(dǎo)物存在時，高濃度的 cAMP水平能夠?qū)е氯樘遣倏v子的啟動子發(fā)生高水平的轉(zhuǎn)錄作用。 lac 啟動子 ： （ 1） lac啟動子來源于大腸桿菌的乳糖操縱子，包括啟動子、活化蛋白（ catabolite activator protein, CAP）結(jié)合位點、操縱基因和 lacZ組成。 啟動子有 強 /弱之分。 5) 終止子（ A terminator） 。第二章 原核微生物的基因表達與操作 原核微生物的基因表達及其調(diào)控 原核微生物的基因表達產(chǎn)物的分離純化 （ 1）轉(zhuǎn)錄因素； （ 2）翻譯因素； （ 3）蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性； （ 4）胞外分泌的特性 一、原核生物的基因表達 第一節(jié) 原核生物的基因表達與調(diào)控因素 （一）、轉(zhuǎn)錄對基因表達的影響 要注意的關(guān)鍵名詞術(shù)語 : 1) 編碼鏈（有義鏈， the coding strand） 。 9) 轉(zhuǎn)錄起始位
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