原核表達實驗ppt課件(完整版)
【正文】 25mM Tris 192mM glycine 20% methanol 10 TBS緩沖溶液（ 1L） TrisBase ， NaCl 80g ， 緩沖液配方： 第一組，第二組，第三組 配 YPD液體培養(yǎng)基 葡萄糖 20g，酵母提取物 10 g，蛋白胨 (Peptone)20g， 1L。（ 具體擺放順序見下圖 ） ? 于 Towbin buffer中浸潤硝酸纖維素濾膜，然后置于濾紙 /片上，排出氣泡； ? 然后將平衡好的蛋白膠置于硝酸纖維素濾膜上，排出氣泡； ? 再依次將另外 9張濾紙 (1張濾片 )在 Towbin buffer中浸潤后放置在蛋白膠上。 ? 染色完畢后，回收染色液，加入脫色液，搖床脫色數(shù)次，前面幾次可以時間較短，第一次約 10分鐘，依次時間稍微延長，最后一次可以過夜脫色。放置 30分鐘，待膠完全凝固，去除正丁醇。 挑取 1個正確表達目標蛋白的轉化子接種于裝有 2ml LB/Kan（ Kan濃度 50ug/ml）培養(yǎng)基的 PA瓶中， 37oC培養(yǎng)過夜； 按 1%接種量接種于 50ml LB/Kan （ Kan濃度 50ug/ml）中37 ℃ 培養(yǎng)約 2小時 40分鐘， OD600=；（ 前兩步與 操作步驟 1相同 ） 培養(yǎng)完畢后，向三角瓶中加入 IPTG（ 100mM） 50μl，使培養(yǎng)液中 IPTG終濃度為 ； 28 ℃ 誘導培養(yǎng)， 250rpm，約 4小時后收集菌體； 吸菌液 1ml于 ，另取 20ml倒入 50ml離心管中 ,離心收集菌體 ,8000 rpm， 4 ℃ ， 5分鐘去除培養(yǎng)基，加入 2ml 1 PBS緩沖液懸浮菌體，然后分裝于 2個 ，10000rpm，離心 2分鐘，去上清， 20℃ 保存?zhèn)溆?。一般的點樣量為 1020ul。 蛋白濃度標準曲線的繪制 y = 2 + R2 = 010 1 2 ug/mlA595取出保存的誘導后的細胞（ 10ml），在冰上緩慢融化后，加入 1mlPBS緩沖液； 置冰上用超聲波破碎細胞，將超聲波發(fā)射探頭插入菌液中，開始超聲， 10 sec/次，間歇 15 sec（避免過度產(chǎn)熱），重復數(shù)次（一般 56次）直至溶液變清亮；所有過程均需在冰上進行； 在 4℃ 、 13000rpm離心 20分鐘，可溶性蛋白存在于上清液中，不溶性蛋白存在于沉淀中； 實驗三： 表達蛋白的純化 細胞破碎上清液中，加入 NiNTA樹脂柱，在 4℃ 下結合1h(離心管平放在冰盒中）， 每 5分鐘搖動一次（防止柱子沉積在底部 )；然后 5000 r/min離心 1 min移除上清液； 4℃ 條件下 50 mmol/L 1ml(1XPBS buffer)5min/次洗四次，加入 40 mmol/L咪唑 (imidazole)1xPBS緩沖液洗脫 10min除雜蛋白 ，離心棄上清；保留 NiNTA柱； 加入 500μl 100 mmol/L咪唑 (imidazole)、 50 mmol/L (1XPBS buffer)洗脫液，在 4℃ 條件下洗滌 30min后 5000 r/min離心 1 min
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