【正文】 如酶和底物、抗原和抗體、糖鏈和凝集素等； （ 4）對于具有明顯親水和疏水性的蛋白質(zhì)，可以 選用疏水作用層析和反相作用層析 ； （ 5） 凝膠排阻層析對于除去包含體中的雜蛋白很有效 ：在 E. coli等中表達(dá)的外源蛋白相對分子量均在 ?104左右，而且大多數(shù)以包含體的形式存在，而包含體中的雜質(zhì)蛋白的相對分子量通常大于 ?104。 包含體蛋白的提取步驟： （ 1）菌體的收獲、破碎與包含體的洗滌 一般可在 5000～ 10000?g下離心收集菌體，然后進(jìn)行菌體的破碎。二硫鍵可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)的半衰期； （ 2）所表達(dá)的蛋白質(zhì)的 N端 是否有特定的氨基酸。如 T4噬菌體的 pin基因產(chǎn)物。 一種解決的途徑：使用 “ 雙質(zhì)粒系統(tǒng) ” ：用 trp啟動子帶動編碼 cI阻遏蛋白的基因，然后將它們置于一個弱啟動子的載體上；將要表達(dá)的外源基因置于強(qiáng)啟動子 PL之下，使其受 PL啟動子的控制。 所有含 lac啟動子的表達(dá)載體都受到 IPTG的誘導(dǎo)。 trp promoter色氨酸啟動子 由色氨酸阻遏蛋白進(jìn)行調(diào)控：正調(diào)控作用。 E. coli的啟動子： （ 1） 10 region： TATA box（ Pribnow box） T77A76T60A61A56T82 （ 2） 35 region： 為 RNA pol I初始結(jié)合區(qū)。 6) 轉(zhuǎn)錄單位（ A transcription unit） 。 。 4) lacA：硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙?；? cAMP參與乳糖操縱子的調(diào)控： （ 1） cAMP通過與 cAMP受體蛋白（ CRP）結(jié)合，引起 CRP構(gòu) 象變化，形成一種有活性的 cAMPCRP復(fù)合物； （ 2）乳糖操縱子啟動基因（ O）有 2個位點(diǎn)：一個與 RNA聚合 酶結(jié)合；另一個與 cAMPCRP結(jié)合，而且只有后者結(jié)合 后才能與啟動基因結(jié)合，啟動轉(zhuǎn)錄過程； （ 3） cAMPCRP復(fù)合物不僅可以與一個啟動基因結(jié)合，而且 還可以與幾個操縱子上的啟動基因結(jié)合，從而影響到許 多操縱子。 含 lac 啟動子的表達(dá)載體： 多種。 質(zhì)粒 pKN402的復(fù)制起始位點(diǎn)是耐溫型的，在 42?C時仍然有很強(qiáng)的復(fù)制起始的功能。如枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis）蛋白酶活性強(qiáng)，而且具有外分泌性，但短芽孢桿菌（ Bacillus brevis）的蛋白酶活性就低得多； （ 2）用黃嘌呤營養(yǎng)缺陷型菌株（ Ion－ ）作為受體菌。 （九）增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 構(gòu)建和表達(dá)長半衰期的外源蛋白。 菌體常用破碎方法： ① 物理方法： Sonication/French Pressure ② 化學(xué)方法： Lysozyme（溶菌酶）、表面活性劑、 強(qiáng)堿（須考慮外源蛋白的耐受性） 洗滌目的：去除吸附在包含體表面的不溶性雜蛋白。 一般變性時要考慮以下幾方面的因素： ① 變性劑的濃度及變化率； ② 外源蛋白的濃度及其純度； ③ 氧化還原劑的選擇； ④ pH值的選擇； ⑤ 適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度； ⑥ 合適的溫度和作用時間； ⑦ 分子伴侶的作用（ chaperone） （二）表達(dá)蛋白純化的基本原則 針對不同的產(chǎn)物表達(dá)形式采取不同的策略； （ 1）對于體積大、濃度低的分泌蛋白體系，先通常先要進(jìn)行濃縮處理， 如沉淀、超濾； （ 2）可溶性表達(dá)產(chǎn)物先用親和層析法進(jìn)行純化； （ 3）對于在壁膜間隙中表達(dá)的蛋白介于分泌性蛋白和細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白兩者之間，可以先用 低濃度溶菌酶 處理，再用滲透壓休克法進(jìn)行純化； 針對不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)選用不同的層析類型 （ 1） 用離子交換層析分離具有不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)。 一般等電點(diǎn)處于極端位置（ pI5或 pI8）的基因工程蛋白質(zhì)應(yīng)首選離子交換層析方法； （ 3） 不同蛋白質(zhì)可以選用不同的特異性親和配基。加入的洗滌液可以通過柱層析等方法除去。 （ 3）在可能的情況下，改變蛋白質(zhì)中的 “ PEST”序列，但這種改變不能影響蛋白質(zhì)的功能。 融合蛋白的表達(dá) 1. “三夾板”式融合 2. 3. C末端融合 N末端融合 運(yùn)載蛋白 運(yùn)載蛋白 異源功能蛋白 運(yùn)載蛋白 運(yùn)載蛋白 異源功能蛋白 異源功能蛋白 通過在細(xì)胞膜跨膜蛋白中“鑲嵌”外源蛋白，是一種典型的 “三夾板”式融合方式 pPC?系列載體： pPC???Z1， pPC???Z2和 pPC???Z3。 ?半乳糖苷酶在不同受體菌中的表達(dá)： 攜帶包含大腸桿菌 lacZ 基因和異源啟動子的質(zhì)粒載體的不同革蘭氏陰性菌受體菌中測定的 ? 半乳糖苷酶活性 ? G al acto sidas e a cti vity (U) in : Promoter Escher ichia coli Rh i zobium melil oti Rh i zobium legumi no s arum Pseud omo na s pu ti d a None 16 110 130 150 Nm 1,40 0 21 , 800 13 , 900 16 , 300 lac 2,00 0 9,05 0 6,25 0 9,80 0 tac 11 , 300 2,85 0 1,15 0 2,95 0 S1 40 3,30 0 1,20 0 3,35 0 苜蓿根瘤菌 豌豆根瘤菌 惡臭假單胞菌 大腸桿菌 ?半乳糖苷酶在不同受體菌中的表達(dá)分析： (1) 所有啟動子在受體菌中都有一定的活性； (2) tac啟動子在大腸桿菌中活性最高，但是在其它受體菌中活性最低； (3) 新霉素基因啟動子（ Nm）是在大腸桿菌中活性最低的啟動子，但是在其它受體菌中驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的活性卻最高。 如： pDR720 質(zhì)粒 pDR720是一個含 trp啟動子的表達(dá)載體，它來源于 p51， trp啟動子在 Sma I位點(diǎn)插入，在啟動子的下游有 3個位點(diǎn)， Sal I、 BamH I和 Sma I，可以插入外源基因。 （ 1）由 trpR產(chǎn)生的阻遏蛋白只有在與色氨酸結(jié)合后才能形成有活性的阻遏蛋白，它可以與操縱基因結(jié)合從而阻止轉(zhuǎn)錄的起始。 （一）可調(diào)控啟動子 (Regulatable Promote