【正文】 （群落水平生理學模型）。如果大量的物種負責簡單的功能，任何物種的消失對于土壤過程都不會有任何的影響，因為其他的有機體會填充這個功能空隙。那些在機能上冗余的物種隨著時間的變化 也不再有很多。這是因為在這種條件下具有優(yōu)勢的物種在各處有利的小生境中都會受到偏愛。 MacArthur 假設當一個低多樣性（ L）的群落（這里，兩個成員）在受到外界干擾，如一個群落成員減少 50%，這種干擾比對一個高多樣性的群落（ H,20 個物種）來說影響要大。 4 圖 2 外界因素決定多樣性，反過來影響生態(tài)系統(tǒng) 特性，像穩(wěn)定性、抵抗力、豐富度和生產力 生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性相關 理論 的出現 已經有近 50 年了，并且被認為是早期生態(tài)學理論的核心法則。事實上，在一塊土壤中，有許多的微生境，例如根際、根圍、碎石、腐殖質或大塊土壤。這個延伸的觀點似乎更適合于土壤環(huán)境的復雜性。在這點上， 有關轉基因 DNA 在土壤中殘留的研究已經考慮到與植物相關的細菌與轉基因 DNA 之間的轉化。 為慶祝意大利土壤科學協會成立五十周年， 2020 年我們在意大利的愛瑞斯召開了土壤緊急會議。 諸多 土壤問題例如土壤流失、土壤退化和土壤污染等， 居于 人類在第三個一千年中為保護地球和保證人類生存必須解決的 15 個危機 之中。生態(tài)系統(tǒng)由互相依存的物種群落以及與其相關的自然 環(huán)境所組成， 其 大小不一。除了與農業(yè)實踐、季節(jié)、田地位置和年代這些相關的環(huán)境因素以外，人們開始越來越關注轉基因植物對微生物群落的影響。 V. Torsvik H. Insam傳統(tǒng)的分析方法很有效 ，但是隨著分子學方法的應用，現在 既 可以檢測 出可培養(yǎng)又可以檢測出不可培養(yǎng)的微生物物種。 關鍵詞： 生物多樣性； DNA；遺傳多樣性；分子學方法；多聚鏈反應 1 前言 生物多樣性是指一系列的動植 物物種，以及其遺傳物質和所屬的生態(tài)系統(tǒng)，它包括生態(tài)系統(tǒng)、 物種和基因多樣性。它 包括 生存于地球上的所有動植物和微生物的全部遺傳信息。一篇 最近的文獻（ Nannipieri 等 .2020）綜述了土壤微生物群落、其多樣性以及其功能之間的相互關系。分子生態(tài)學正在突飛猛進的發(fā)展，分子工具靶標功能基因將會彌補多樣性 結構信息和微生物活力之間的空缺，這只是時間的問題。本文將此概念擴大，在生物 變型級別以下用高流量分析或者整體性的工具來評估個體多樣性。 Whittaker 建議將 某一生活環(huán)境 的群落 的物種多樣性（ α多樣性），比率、 物種變化隨生活環(huán)境梯度變化的程度（ β多樣性） 和同一系列生活環(huán)境的物種豐 度（ γ多樣性）區(qū)分開來。這些因素有食物 關系、生活環(huán)境時間和空間的差異、干擾和富營養(yǎng)化。 May挑戰(zhàn) MacArthur 的假設并且說明這種干擾應該是絕對值 ，在這種情況下兩個群落對于干擾的敏感程度是相同的。 資源不均一性 假說 該假設說明 當一個區(qū)域在資源可利用性方面均一的貧瘠時，它將很難保持許多物種 5 并且它的生產力也將很低（圖 4）。 保險假說 根據保險假說，通過抵抗干擾的緩沖效應（減少當前生產力變化）和性能增強效應（ 增加當前平均生產力 ），物種豐富度對生態(tài)系統(tǒng)生產力 產生 正面的影響 。 是不是 知道誰 在負責 有機物的降解很重要呢？或者說能不能充分的確定大量的生化途徑是否在正常進行？如果是這樣的話，那么功能多樣性將比結構多樣性更加重要。 而原來 pH 值和底物濃度并不是最優(yōu)的，并且溫度和濕度在浮動變化。 Degens 和 Harris在測量土壤微生物群落對這些化合物 的利用方式時使用了土壤短期反應方法，并且加入了氨基酸、 羧酸、碳水化合物和有機物（底物誘導呼吸）以克服上述缺陷（圖 5）。這些方法有很多的不足。 PCR 聚合鏈反應， DGGE 變性梯 度凝膠電泳， SSCP 單鏈構象多態(tài)性， TRFLP 末端限制性片段電泳， RISA 基因間隔區(qū)分析， %G+C 摩爾 %鳥嘌呤 +胞嘧啶 從微生物群落獲得的總基因組 DNA（元基因組）可以提供全部群落結構和總遺傳多樣性的補充信息。 rRNA 或者 rDNA的限制性分析 [擴增核糖體 DNA 限制性分析（ ARDRA）；末端限制性片段電泳（ TRFLP） ]可以在高水平的分類學等級進行區(qū)分，甚至可以鑒別到種。這個由熱變性即可測定，因為單鏈 DNA 比雙鏈 DNA 在 260nm的吸光能力大概高 35%。從另外一方面來說，如果群落之間有不同的堿基差異，這可以有力的說明它們之間物種組成 是不同的。 C0t1/2（ 50%DNA 重聯時 ）用來估計 DNA 的復雜性 。氮氣和甲烷影響的土壤 DNA 的 C0t1/2值 分別減少到了 2500 摩爾每秒每升和 300 摩爾每秒每升。低分辨率 比較分析群落組成的全部變化 PCRDGGE/TGGE 個別條帶測序 群落遺傳指紋圖譜，優(yōu)勢群落成員的聯系。中等分辨率 比較分析群落結構，檢測和鑒定活細胞，群落成員的直接系統(tǒng)發(fā)育信息 注： G+C 鳥嘌呤 +胞嘧啶， PCR 聚合鏈反應， DGGE變性梯度凝膠電泳， TGGE溫度梯度凝膠電泳， SSCP 單鏈構象多態(tài)性， TRFLP末端限制性片段電泳， ARDRA擴增核糖體 DNA限制性分析， RISA基因間隔區(qū)分析， FISH熒光原 位雜交 11 表 2 在 6 倍檸檬酸鹽、 30%二甲亞砜中計算得出的微生物群落遺傳多樣性重新組合動力學 DNA 來源 C0t1/2 土壤群落 DNA 堿基大小 （ bp） DNA 土壤 / 大腸桿菌 DNA 大腸桿菌 106 1 牧地土壤（ StendO） 6300 1010 8000 耕種土壤（ StendS） 270 109 340 污泥修復的土壤；未污染的 7800 1010 9800 污泥修復的土壤；低金屬的 3700 1010 4600 污泥修復的土壤；高金屬 的 1200 109 1500 注： 土壤群落 DNA 大小用堿基對（ bp），相等的大腸桿菌基因組（ ： 106bp）（ (Br248。然而，為了更好的估計 C0t1/2值 需要重復多次以達到 50%的重聯率。 核糖體 RNA 基因（ rDNA） 以及 它們的 轉錄片段和 rRNA 分子是分類鑒定和衡量微生物遺傳多樣性最常用的標記物。但是，基于 PCR 的技術也有很多的缺陷，例如 ：由于優(yōu)先擴增某些細菌的目標 DNA 序列而導致的 PCR 擴增差異；形成嵌合分子；由于許多的操縱子的存在導致從一株細菌獲得許多不同的 PCR 擴增產物；復雜群落的擴增產物數量太多以至于很難分離和分析。 使用可以與可變區(qū)附近的保守區(qū)退火的引物，對 微生物群落 DNA 中的 rDNA的可變區(qū)（ 230500bp）進行 PCR 擴增。 DGGE/TGGE 在快速篩選大量樣本以區(qū)分土壤微生物群落時很有效。這種方法的可重復性和辨別能力取決于片段的大小和片段內序列變化的 位置，通常片段小于400bp 效果最理想。熒光標記的片段可以在自動分析儀里通過熒光檢測器進行檢測 ，因此，這種技術只檢測末端標記的限制性片段。然后，酶切樣品數據與使用數據庫序列獲得的已知細菌的 rDNA 限制性分析進行比較。 當大量的 PCR 擴增物相似性太高以致于不容易分辨時，遺傳指紋圖譜方法在區(qū)分高度多樣性的群落時就有局限。 雜交技術 該方法是 設計出與 16S rRNA 或者 23S rRNA 序列相應的系統(tǒng)發(fā)育寡核苷酸探針 ，然后 用來和 rRNA 數據庫中的序列進行比對。點墨雜交和熒光原位雜交已經被聯合用于區(qū)分 不同程度的金屬污染的土壤群落結構。從環(huán)境中獲得的 DNA通過克隆載體由 PCR擴增 rRNA基因得到克隆文庫。 重新組合的技術顯示，根據 C0t1/2值計算，微生物群落 DNA 的復雜性 在適于耕種的土壤中大概是 109bp，有機土壤中大概是1010bp。這相當于大約 9800 個具有大腸桿菌基因組大小的不同細菌基因組。 在重度金 16 屬污染土壤中， α變形菌的克隆在數量上占有優(yōu)勢 （圖 9） 。 圖 9 低濃度和高濃度金屬污染的污泥土壤群落結構變化。 熒光假單胞桿菌 SBW25， 分離自甜菜葉面，很容易定植于甜菜的根圍、葉面和小麥的根圍。為了作比較，把菌株 F113G22 進行改造以產生Tn5::lacZY 不產生 DAPG 的衍生的 F133，此菌株沒有阻止植物病原菌真菌生長的能力。 為了保護農民和更加容易的控制或者國際機構或相關當局監(jiān)測，有一個確定一致的國際性的立法將會很有益的。 第一種推測可能影響植物健康或者土壤功能，第二種推測 帶來的影響比較間接 ——標記基因的水平轉移，主要 是看這種水平轉移對于這些基因擴散到其他細菌群落的影響程度。 為了檢測轉基因的影響 ，田間試驗是在隨機選擇的大田種植轉基因植物，并且在不同的點設置未遺傳改造的父本作為對照。 Heuer 等研究了田間條件下馬鈴薯根圍細菌群落的結構和動力學特性，并且與轉基因的表達 T4熔解酵素的馬鈴薯植株做了比較。第三種方法是基于擴增總根圍 DNA 的 16S rRNA 基因片段然后進行 DGGE 分析或者克隆和測序。但是，鑒定許多的分離菌需要對馬鈴薯不同行之間進行統(tǒng)計性的分析。細菌獲得的單鏈 DNA或者通過 同源重組被整合進細菌的基因組，或者形成一個自 動復制元件。有人假設微生物或者 腐敗的植物組織釋放的自由 DNA 可以作為養(yǎng)料或者自生性細菌的遺傳信息儲藏庫。為檢測 DNA 而不依賴于培養(yǎng)方法，他們直接從土壤中提取總群落 DNA，然后選用三個針對轉基因 DNA 的不同的特殊引物來進行擴增。與前面的研究相比， De Vries 等運用一種新的特殊的生物監(jiān)測技術發(fā)現田間土壤中的轉基因植物的 DNA 最長可以留存達四年。這兩項研究都得出了相同的結果，即 Aciobacter 被轉化了并且內部被切除的 nptII 基因作為同源序列和偵測系統(tǒng)（導致具有卡那霉素抗性的 nptII 基因整合）。據作者估計，是因為非無菌土壤中的轉化株的數量在 1010到 1011之間，這個數值低于可以檢測到的范圍。 用來刺激 Aciobacter 種群轉化能力的營養(yǎng)溶液包含無機鹽和簡單的復合物，這相當于根圍分泌物。從污泥、糞便、河水到土壤中的細菌，關于使用最廣泛的標記基因 nptII 基因的擴散的研究證實， 在高比例的卡那霉素抗性的腸道細菌內，抗性是由 nptII 基因編碼的。所以，公眾對于轉基因植物中的抗性基因的爭論并不能轉移人們對于引起細菌產生抗生素抗性的真正原因，例如醫(yī)學上和畜牧業(yè)中繼續(xù)濫用和過量使用抗生素。 當然，這不適用于特殊的功能。 轉基因的 DNA 在植物衰老過程中會被植物核酸酶降解，或者在微生物降解土壤中殘留的植物時被降解。 。關于抗性基因從轉基因植物轉移到細菌的觀察有相矛盾的結果。 或許檢測主要物種 組成的變化 更有價值，例如 硝化細菌， 只負責土壤生化過程的一部分，像自生固氮菌。 May等使用數學模型證明，隨著相互影響的物種數量的增加，整個系統(tǒng)的穩(wěn)定性會降低，除非遇到特殊的條件。 在不同的環(huán)境之間存在大量的抗性基因和抗性細菌的移動。與此相比，報道較多的是不同環(huán)境條件下結合或 者運用 水平基因轉移 。在同源 DNA 存在的情況下，通過自然轉化來進行基因轉移的研究顯示，當攻擊性的同源出現時 ，非同源遺傳材料的附加整合才會發(fā)生。已經證實當感染青枯病菌的番茄被灌輸質粒DNA 或者被攜帶不同遺傳標記的青枯病菌共同 感染時會發(fā)生基因交換。直到現在，人們都沒有弄清楚細菌是否可以被植物 DNA 所轉化。 在土壤微生境下運用自由的轉基因 DNA 進行相似的實驗，也說明其可以長久的留存。微生物活力被 認為是影響土壤中自由 DNA 留存的重要生物因素，因為微生物活力受刺激經常引起 DNA 酶活力隨著增加。實驗證明，大于 40 個來自不同環(huán)境的細菌物種是可以發(fā)生自然轉化 的。 在其他的溫室條件下的研究中 報道了轉基因植物對土壤微生物和過程的瞬時的影響。在此項研究中， 所有的方法都顯示是與植物生長階段、田間位置或者季節(jié)相關的環(huán)境因素影響根圍群落，而不是轉基因植物表達的 T4 熔解酵素。ring和 Mahn將遺傳改造目標改為細菌，發(fā)現與植物相關的細菌確實受到了影響， 至于易受轉基因馬鈴薯影響的 胡蘿卜軟腐歐文氏菌 明顯的減少了。 通常人們檢測不同的轉化水