【正文】 （群落水平生理學(xué)模型）。如果大量的物種負(fù)責(zé)簡(jiǎn)單的功能，任何物種的消失對(duì)于土壤過(guò)程都不會(huì)有任何的影響，因?yàn)槠渌挠袡C(jī)體會(huì)填充這個(gè)功能空隙。那些在機(jī)能上冗余的物種隨著時(shí)間的變化 也不再有很多。這是因?yàn)樵谶@種條件下具有優(yōu)勢(shì)的物種在各處有利的小生境中都會(huì)受到偏愛(ài)。 MacArthur 假設(shè)當(dāng)一個(gè)低多樣性（ L）的群落（這里，兩個(gè)成員）在受到外界干擾，如一個(gè)群落成員減少 50%，這種干擾比對(duì)一個(gè)高多樣性的群落（ H,20 個(gè)物種）來(lái)說(shuō)影響要大。 4 圖 2 外界因素決定多樣性，反過(guò)來(lái)影響生態(tài)系統(tǒng) 特性，像穩(wěn)定性、抵抗力、豐富度和生產(chǎn)力 生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性相關(guān) 理論 的出現(xiàn) 已經(jīng)有近 50 年了，并且被認(rèn)為是早期生態(tài)學(xué)理論的核心法則。事實(shí)上，在一塊土壤中，有許多的微生境，例如根際、根圍、碎石、腐殖質(zhì)或大塊土壤。這個(gè)延伸的觀點(diǎn)似乎更適合于土壤環(huán)境的復(fù)雜性。在這點(diǎn)上， 有關(guān)轉(zhuǎn)基因 DNA 在土壤中殘留的研究已經(jīng)考慮到與植物相關(guān)的細(xì)菌與轉(zhuǎn)基因 DNA 之間的轉(zhuǎn)化。 為慶祝意大利土壤科學(xué)協(xié)會(huì)成立五十周年， 2020 年我們?cè)谝獯罄膼?ài)瑞斯召開(kāi)了土壤緊急會(huì)議。 諸多 土壤問(wèn)題例如土壤流失、土壤退化和土壤污染等， 居于 人類在第三個(gè)一千年中為保護(hù)地球和保證人類生存必須解決的 15 個(gè)危機(jī) 之中。生態(tài)系統(tǒng)由互相依存的物種群落以及與其相關(guān)的自然 環(huán)境所組成， 其 大小不一。除了與農(nóng)業(yè)實(shí)踐、季節(jié)、田地位置和年代這些相關(guān)的環(huán)境因素以外，人們開(kāi)始越來(lái)越關(guān)注轉(zhuǎn)基因植物對(duì)微生物群落的影響。 V. Torsvik H. Insam傳統(tǒng)的分析方法很有效 ，但是隨著分子學(xué)方法的應(yīng)用，現(xiàn)在 既 可以檢測(cè) 出可培養(yǎng)又可以檢測(cè)出不可培養(yǎng)的微生物物種。 關(guān)鍵詞： 生物多樣性； DNA；遺傳多樣性；分子學(xué)方法；多聚鏈反應(yīng) 1 前言 生物多樣性是指一系列的動(dòng)植 物物種，以及其遺傳物質(zhì)和所屬的生態(tài)系統(tǒng)，它包括生態(tài)系統(tǒng)、 物種和基因多樣性。它 包括 生存于地球上的所有動(dòng)植物和微生物的全部遺傳信息。一篇 最近的文獻(xiàn)（ Nannipieri 等 .2020）綜述了土壤微生物群落、其多樣性以及其功能之間的相互關(guān)系。分子生態(tài)學(xué)正在突飛猛進(jìn)的發(fā)展，分子工具靶標(biāo)功能基因?qū)?huì)彌補(bǔ)多樣性 結(jié)構(gòu)信息和微生物活力之間的空缺，這只是時(shí)間的問(wèn)題。本文將此概念擴(kuò)大，在生物 變型級(jí)別以下用高流量分析或者整體性的工具來(lái)評(píng)估個(gè)體多樣性。 Whittaker 建議將 某一生活環(huán)境 的群落 的物種多樣性（ α多樣性），比率、 物種變化隨生活環(huán)境梯度變化的程度（ β多樣性） 和同一系列生活環(huán)境的物種豐 度（ γ多樣性）區(qū)分開(kāi)來(lái)。這些因素有食物 關(guān)系、生活環(huán)境時(shí)間和空間的差異、干擾和富營(yíng)養(yǎng)化。 May挑戰(zhàn) MacArthur 的假設(shè)并且說(shuō)明這種干擾應(yīng)該是絕對(duì)值 ，在這種情況下兩個(gè)群落對(duì)于干擾的敏感程度是相同的。 資源不均一性 假說(shuō) 該假設(shè)說(shuō)明 當(dāng)一個(gè)區(qū)域在資源可利用性方面均一的貧瘠時(shí)，它將很難保持許多物種 5 并且它的生產(chǎn)力也將很低（圖 4）。 保險(xiǎn)假說(shuō) 根據(jù)保險(xiǎn)假說(shuō)，通過(guò)抵抗干擾的緩沖效應(yīng)（減少當(dāng)前生產(chǎn)力變化）和性能增強(qiáng)效應(yīng)（ 增加當(dāng)前平均生產(chǎn)力 ），物種豐富度對(duì)生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力 產(chǎn)生 正面的影響 。 是不是 知道誰(shuí) 在負(fù)責(zé) 有機(jī)物的降解很重要呢？或者說(shuō)能不能充分的確定大量的生化途徑是否在正常進(jìn)行？如果是這樣的話，那么功能多樣性將比結(jié)構(gòu)多樣性更加重要。 而原來(lái) pH 值和底物濃度并不是最優(yōu)的，并且溫度和濕度在浮動(dòng)變化。 Degens 和 Harris在測(cè)量土壤微生物群落對(duì)這些化合物 的利用方式時(shí)使用了土壤短期反應(yīng)方法，并且加入了氨基酸、 羧酸、碳水化合物和有機(jī)物（底物誘導(dǎo)呼吸）以克服上述缺陷（圖 5）。這些方法有很多的不足。 PCR 聚合鏈反應(yīng)， DGGE 變性梯 度凝膠電泳， SSCP 單鏈構(gòu)象多態(tài)性， TRFLP 末端限制性片段電泳， RISA 基因間隔區(qū)分析， %G+C 摩爾 %鳥(niǎo)嘌呤 +胞嘧啶 從微生物群落獲得的總基因組 DNA（元基因組）可以提供全部群落結(jié)構(gòu)和總遺傳多樣性的補(bǔ)充信息。 rRNA 或者 rDNA的限制性分析 [擴(kuò)增核糖體 DNA 限制性分析（ ARDRA）；末端限制性片段電泳（ TRFLP） ]可以在高水平的分類學(xué)等級(jí)進(jìn)行區(qū)分，甚至可以鑒別到種。這個(gè)由熱變性即可測(cè)定，因?yàn)閱捂?DNA 比雙鏈 DNA 在 260nm的吸光能力大概高 35%。從另外一方面來(lái)說(shuō)，如果群落之間有不同的堿基差異，這可以有力的說(shuō)明它們之間物種組成 是不同的。 C0t1/2（ 50%DNA 重聯(lián)時(shí) ）用來(lái)估計(jì) DNA 的復(fù)雜性 。氮?dú)夂图淄橛绊懙耐寥?DNA 的 C0t1/2值 分別減少到了 2500 摩爾每秒每升和 300 摩爾每秒每升。低分辨率 比較分析群落組成的全部變化 PCRDGGE/TGGE 個(gè)別條帶測(cè)序 群落遺傳指紋圖譜，優(yōu)勢(shì)群落成員的聯(lián)系。中等分辨率 比較分析群落結(jié)構(gòu)，檢測(cè)和鑒定活細(xì)胞，群落成員的直接系統(tǒng)發(fā)育信息 注： G+C 鳥(niǎo)嘌呤 +胞嘧啶， PCR 聚合鏈反應(yīng)， DGGE變性梯度凝膠電泳， TGGE溫度梯度凝膠電泳， SSCP 單鏈構(gòu)象多態(tài)性， TRFLP末端限制性片段電泳， ARDRA擴(kuò)增核糖體 DNA限制性分析， RISA基因間隔區(qū)分析， FISH熒光原 位雜交 11 表 2 在 6 倍檸檬酸鹽、 30%二甲亞砜中計(jì)算得出的微生物群落遺傳多樣性重新組合動(dòng)力學(xué) DNA 來(lái)源 C0t1/2 土壤群落 DNA 堿基大小 （ bp） DNA 土壤 / 大腸桿菌 DNA 大腸桿菌 106 1 牧地土壤（ StendO） 6300 1010 8000 耕種土壤（ StendS） 270 109 340 污泥修復(fù)的土壤；未污染的 7800 1010 9800 污泥修復(fù)的土壤；低金屬的 3700 1010 4600 污泥修復(fù)的土壤；高金屬 的 1200 109 1500 注： 土壤群落 DNA 大小用堿基對(duì)（ bp），相等的大腸桿菌基因組（ ： 106bp）（ (Br248。然而，為了更好的估計(jì) C0t1/2值 需要重復(fù)多次以達(dá)到 50%的重聯(lián)率。 核糖體 RNA 基因（ rDNA） 以及 它們的 轉(zhuǎn)錄片段和 rRNA 分子是分類鑒定和衡量微生物遺傳多樣性最常用的標(biāo)記物。但是，基于 PCR 的技術(shù)也有很多的缺陷，例如 ：由于優(yōu)先擴(kuò)增某些細(xì)菌的目標(biāo) DNA 序列而導(dǎo)致的 PCR 擴(kuò)增差異；形成嵌合分子；由于許多的操縱子的存在導(dǎo)致從一株細(xì)菌獲得許多不同的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；復(fù)雜群落的擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量太多以至于很難分離和分析。 使用可以與可變區(qū)附近的保守區(qū)退火的引物，對(duì) 微生物群落 DNA 中的 rDNA的可變區(qū)（ 230500bp）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。 DGGE/TGGE 在快速篩選大量樣本以區(qū)分土壤微生物群落時(shí)很有效。這種方法的可重復(fù)性和辨別能力取決于片段的大小和片段內(nèi)序列變化的 位置，通常片段小于400bp 效果最理想。熒光標(biāo)記的片段可以在自動(dòng)分析儀里通過(guò)熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè) ，因此，這種技術(shù)只檢測(cè)末端標(biāo)記的限制性片段。然后，酶切樣品數(shù)據(jù)與使用數(shù)據(jù)庫(kù)序列獲得的已知細(xì)菌的 rDNA 限制性分析進(jìn)行比較。 當(dāng)大量的 PCR 擴(kuò)增物相似性太高以致于不容易分辨時(shí)，遺傳指紋圖譜方法在區(qū)分高度多樣性的群落時(shí)就有局限。 雜交技術(shù) 該方法是 設(shè)計(jì)出與 16S rRNA 或者 23S rRNA 序列相應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育寡核苷酸探針 ，然后 用來(lái)和 rRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)。點(diǎn)墨雜交和熒光原位雜交已經(jīng)被聯(lián)合用于區(qū)分 不同程度的金屬污染的土壤群落結(jié)構(gòu)。從環(huán)境中獲得的 DNA通過(guò)克隆載體由 PCR擴(kuò)增 rRNA基因得到克隆文庫(kù)。 重新組合的技術(shù)顯示，根據(jù) C0t1/2值計(jì)算，微生物群落 DNA 的復(fù)雜性 在適于耕種的土壤中大概是 109bp，有機(jī)土壤中大概是1010bp。這相當(dāng)于大約 9800 個(gè)具有大腸桿菌基因組大小的不同細(xì)菌基因組。 在重度金 16 屬污染土壤中， α變形菌的克隆在數(shù)量上占有優(yōu)勢(shì) （圖 9） 。 圖 9 低濃度和高濃度金屬污染的污泥土壤群落結(jié)構(gòu)變化。 熒光假單胞桿菌 SBW25， 分離自甜菜葉面，很容易定植于甜菜的根圍、葉面和小麥的根圍。為了作比較，把菌株 F113G22 進(jìn)行改造以產(chǎn)生Tn5::lacZY 不產(chǎn)生 DAPG 的衍生的 F133，此菌株沒(méi)有阻止植物病原菌真菌生長(zhǎng)的能力。 為了保護(hù)農(nóng)民和更加容易的控制或者國(guó)際機(jī)構(gòu)或相關(guān)當(dāng)局監(jiān)測(cè)，有一個(gè)確定一致的國(guó)際性的立法將會(huì)很有益的。 第一種推測(cè)可能影響植物健康或者土壤功能，第二種推測(cè) 帶來(lái)的影響比較間接 ——標(biāo)記基因的水平轉(zhuǎn)移，主要 是看這種水平轉(zhuǎn)移對(duì)于這些基因擴(kuò)散到其他細(xì)菌群落的影響程度。 為了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的影響 ，田間試驗(yàn)是在隨機(jī)選擇的大田種植轉(zhuǎn)基因植物，并且在不同的點(diǎn)設(shè)置未遺傳改造的父本作為對(duì)照。 Heuer 等研究了田間條件下馬鈴薯根圍細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)特性，并且與轉(zhuǎn)基因的表達(dá) T4熔解酵素的馬鈴薯植株做了比較。第三種方法是基于擴(kuò)增總根圍 DNA 的 16S rRNA 基因片段然后進(jìn)行 DGGE 分析或者克隆和測(cè)序。但是，鑒定許多的分離菌需要對(duì)馬鈴薯不同行之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)性的分析。細(xì)菌獲得的單鏈 DNA或者通過(guò) 同源重組被整合進(jìn)細(xì)菌的基因組，或者形成一個(gè)自 動(dòng)復(fù)制元件。有人假設(shè)微生物或者 腐敗的植物組織釋放的自由 DNA 可以作為養(yǎng)料或者自生性細(xì)菌的遺傳信息儲(chǔ)藏庫(kù)。為檢測(cè) DNA 而不依賴于培養(yǎng)方法，他們直接從土壤中提取總?cè)郝?DNA，然后選用三個(gè)針對(duì)轉(zhuǎn)基因 DNA 的不同的特殊引物來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增。與前面的研究相比， De Vries 等運(yùn)用一種新的特殊的生物監(jiān)測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)田間土壤中的轉(zhuǎn)基因植物的 DNA 最長(zhǎng)可以留存達(dá)四年。這兩項(xiàng)研究都得出了相同的結(jié)果，即 Aciobacter 被轉(zhuǎn)化了并且內(nèi)部被切除的 nptII 基因作為同源序列和偵測(cè)系統(tǒng)（導(dǎo)致具有卡那霉素抗性的 nptII 基因整合）。據(jù)作者估計(jì)，是因?yàn)榉菬o(wú)菌土壤中的轉(zhuǎn)化株的數(shù)量在 1010到 1011之間，這個(gè)數(shù)值低于可以檢測(cè)到的范圍。 用來(lái)刺激 Aciobacter 種群轉(zhuǎn)化能力的營(yíng)養(yǎng)溶液包含無(wú)機(jī)鹽和簡(jiǎn)單的復(fù)合物，這相當(dāng)于根圍分泌物。從污泥、糞便、河水到土壤中的細(xì)菌，關(guān)于使用最廣泛的標(biāo)記基因 nptII 基因的擴(kuò)散的研究證實(shí)， 在高比例的卡那霉素抗性的腸道細(xì)菌內(nèi)，抗性是由 nptII 基因編碼的。所以，公眾對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物中的抗性基因的爭(zhēng)論并不能轉(zhuǎn)移人們對(duì)于引起細(xì)菌產(chǎn)生抗生素抗性的真正原因，例如醫(yī)學(xué)上和畜牧業(yè)中繼續(xù)濫用和過(guò)量使用抗生素。 當(dāng)然，這不適用于特殊的功能。 轉(zhuǎn)基因的 DNA 在植物衰老過(guò)程中會(huì)被植物核酸酶降解，或者在微生物降解土壤中殘留的植物時(shí)被降解。 。關(guān)于抗性基因從轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)移到細(xì)菌的觀察有相矛盾的結(jié)果。 或許檢測(cè)主要物種 組成的變化 更有價(jià)值，例如 硝化細(xì)菌， 只負(fù)責(zé)土壤生化過(guò)程的一部分，像自生固氮菌。 May等使用數(shù)學(xué)模型證明，隨著相互影響的物種數(shù)量的增加，整個(gè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性會(huì)降低，除非遇到特殊的條件。 在不同的環(huán)境之間存在大量的抗性基因和抗性細(xì)菌的移動(dòng)。與此相比，報(bào)道較多的是不同環(huán)境條件下結(jié)合或 者運(yùn)用 水平基因轉(zhuǎn)移 。在同源 DNA 存在的情況下，通過(guò)自然轉(zhuǎn)化來(lái)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的研究顯示，當(dāng)攻擊性的同源出現(xiàn)時(shí) ，非同源遺傳材料的附加整合才會(huì)發(fā)生。已經(jīng)證實(shí)當(dāng)感染青枯病菌的番茄被灌輸質(zhì)粒DNA 或者被攜帶不同遺傳標(biāo)記的青枯病菌共同 感染時(shí)會(huì)發(fā)生基因交換。直到現(xiàn)在，人們都沒(méi)有弄清楚細(xì)菌是否可以被植物 DNA 所轉(zhuǎn)化。 在土壤微生境下運(yùn)用自由的轉(zhuǎn)基因 DNA 進(jìn)行相似的實(shí)驗(yàn)，也說(shuō)明其可以長(zhǎng)久的留存。微生物活力被 認(rèn)為是影響土壤中自由 DNA 留存的重要生物因素，因?yàn)槲⑸锘盍κ艽碳そ?jīng)常引起 DNA 酶活力隨著增加。實(shí)驗(yàn)證明，大于 40 個(gè)來(lái)自不同環(huán)境的細(xì)菌物種是可以發(fā)生自然轉(zhuǎn)化 的。 在其他的溫室條件下的研究中 報(bào)道了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)土壤微生物和過(guò)程的瞬時(shí)的影響。在此項(xiàng)研究中， 所有的方法都顯示是與植物生長(zhǎng)階段、田間位置或者季節(jié)相關(guān)的環(huán)境因素影響根圍群落，而不是轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的 T4 熔解酵素。ring和 Mahn將遺傳改造目標(biāo)改為細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)與植物相關(guān)的細(xì)菌確實(shí)受到了影響， 至于易受轉(zhuǎn)基因馬鈴薯影響的 胡蘿卜軟腐歐文氏菌 明顯的減少了。 通常人們檢測(cè)不同的轉(zhuǎn)化水