流式細(xì)胞術(shù)的樣品制備-文庫(kù)吧在線文庫(kù)
【正文】 %胰酶，消化細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察，見(jiàn)細(xì)胞稍變圓時(shí)，立即終止消化（假如含有 10%胎牛血清的培養(yǎng)基），收集細(xì)胞，離心后去上清， PBS液洗滌細(xì)胞一次，離心去掉上清液，約留 ，用振蕩器使細(xì)胞分散。 酶消化法是實(shí)體組織分散為單細(xì)胞的主要方法，常用的酶類(lèi)試劑有： ? 蛋白酶類(lèi)， (如胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，鏈蛋白酶和中性蛋白酶等 )都能夠釋放所有組織中的細(xì)胞； ? 胰酶，能水解脂鍵和肽鍵； ? 膠原酶，能降解幾種分子類(lèi)型的膠原； ? 溶菌酶，能水解糖蛋白和肽的糖苷鍵； ? 彈性蛋白酶，能消化連接組織的糖蛋白和彈性蛋白的纖維，可用于解離血管、心臟和肝臟的細(xì)胞。 ⑤ 將制備好的單細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析或保存。 ⑦ 70%冰乙醇固定，放入 4℃ 冰箱。 ④ 加入生理鹽水 1020ml，沖洗研器。 ②加入 EDTA液 5ml，室溫，半小時(shí)，棄之。 Ⅱ 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x用最佳的細(xì)胞固定方法，以免由于固定劑的原因，造成 FCM檢測(cè)結(jié)果的不穩(wěn)定。 ⑤消化：加入 2ml %胃蛋白酶 (pH值 )置37℃ 恒溫水浴中消化 30分鐘，消化期間每隔 10分鐘振蕩一次。 ? 切片不可過(guò)薄或過(guò)厚，過(guò)薄則碎片增多，影響流式分析結(jié)果，過(guò)厚造成脫蠟不凈或脫蠟時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，一般以 4050μm為宜。 ⒉粒細(xì)胞的比重較淋巴細(xì)胞稍大，因此經(jīng)分離液分離后的粒細(xì)胞，分層于紅細(xì)胞之上，分離液的底部。 5. 脫落下來(lái)的細(xì)胞移入離心管 , 離心沉淀1500prm,5分鐘 ,再以生理鹽水漂洗 2－ 3 次 ,每次離心 800prm,2分鐘 ,以去除碎片雜質(zhì) 。 ， 可用 %胃蛋白酶 ()在 37℃ 水浴箱中消化 510分鐘 ， 振蕩分散為單細(xì)胞懸液 。 ㈤ 沖洗 液 樣品單細(xì)胞懸液制備 300500ml生理鹽水沖洗胃或膀 胱 ， 沖洗一定時(shí)間后 ，吸出沖洗液放入容器中 ， 于冰箱內(nèi)置 612小時(shí) 。 300目篩網(wǎng)過(guò)濾后 ， 以 PBS洗 去 枸櫞 酸緩沖液 ， 離心沉淀去上清 ， 加入 70%乙醇固定備檢 。 ㈠ 宮頸脫落細(xì)胞懸液 的制備 ,以海棉輕拭宮頸表面 ,將海棉中吸附的脫落細(xì)胞洗脫到 20ml生理鹽水中 。 ㈢ 單核細(xì)胞制備 1. 取肝素 1000u/ml抗凝全血 ,加入 鹽水將血稀釋 ,均在無(wú)菌條件下操作。 ⒊離心 2021prm， 30分鐘，室溫 1820℃ ，離心后可見(jiàn)試管內(nèi)的血液清楚的分為 4層，上層為血漿層，中層為分離液層 (淋巴細(xì)胞所處的位置在血漿層與分離液層中間 )，底層為紅細(xì)胞，紅細(xì)胞上為粒細(xì)胞。 ⑨制備好的單細(xì)胞懸液作涂片， AO染色在熒光顯微鏡下觀察，應(yīng)為完整細(xì)胞核，核發(fā)出黃綠色熒光。 實(shí)驗(yàn)方法： ①石蠟包埋組織在切片機(jī)上切取 4050μm厚的組織片 35片。 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，用化學(xué)試劑處理組織
研究報(bào)告相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1