【正文】 ，農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 ? 林業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ CFCC），中國林業(yè)科學院 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 國認外可的菌種收藏機構(gòu) ? 世界菌種保藏聯(lián)合會 WFCC (World Federation Of Culture Collection)全球注冊的菌種保藏機構(gòu) 583家 ? ATCC ? NRRL ? DSMZ ? NCTC ? CMI ? CBS ? NBRC(IFO) ? JCM 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 菌株代數(shù) 美國藥典（ USP）中規(guī)定： “ 將微生物接種至一新鮮培養(yǎng)基上 /內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱為一代， ” 并規(guī)定 “ 菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超過 5代 ” 。 同“－ 80℃ 冰箱凍結(jié)法” 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 液氮超低溫凍結(jié)法 ? 保藏時間長； ? 保藏效果好，菌種不易退化； ? 對設備要求高 (程控降溫儀、液氮罐 )，對人員操作水平要求高； ? 保藏成本高。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 真空度檢測 用高頻電火花檢查各安瓿管的真空情況，如管內(nèi)呈現(xiàn)灰藍 光，說明真空度符合要求。 ? 棉塞 ? 打棉塞， 160℃ 定型 2h； ? 標簽 ? 激光打印標簽，標明菌株編號和保藏日期，大小約 10 20mm。 ? 操作步驟： 斜面制備 接種 培養(yǎng) 保藏 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 ? 斜面制備 培養(yǎng)基配制 分 裝 滅 菌 擺放斜面 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 ? 接 種 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 ? 培養(yǎng) ? 細菌 37 ℃ ， 12d ? 酵母 28~30℃ ， 2~3d ? 絲狀真菌 26 ℃ ， 5~7d ? 保藏 ? 4~6℃ ? 保藏 3~6個月 ? 培養(yǎng)和保藏 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 定期移植法 ? 操作簡單，使用方便； ? 對設備和人員要求不高； ? 可隨時使用，便于觀察菌種； ? 工作勞動強度大，屬短期保藏，保藏成本高； ? 菌種傳代頻繁，易退化、污染。 ? 結(jié)合形態(tài)學、碳源利用情況和 ITS rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析等多相鑒定的結(jié)果 , 將 CMCC(F)98003鑒定為黑曲霉 （ Aspergillus niger ）。 1: ITS rDNA區(qū) PCR擴增結(jié)果 。 C: 分生孢子形態(tài) ( 400). Note: A: Colony morphology, B: Conidiophore morphology ( 100)。 C 1 min, 30個循環(huán) 。 引物 (10 μL/L)各 μL。 9642TM as Aspergillus brasiliensis. Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter, 2022, Vol. 14 (10): 214 表 ITS序列特殊位點堿基差異 Table Difference of base position in ITS sequence 四、微生物鑒定 鑒定實例 2 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 2022年 Aspergillus brasiliensis 2022年 ATCC 16404 鑒定為 Aspergillus brasiliensis . 2022年 USP 將 ATCC 16404 更名 2022年 WDCM 將 ATCC 16404 更名 圖 : 基于曲霉黑色組 β微管蛋白基因序列的 NJ樹 Figure : Neighbour –joining tree based on βtubulin sequence data of Aspergillus section Nigri.. 注：圖片來源于 Aspergillus brasiliensis sp. nov., a biseriate black Aspergillus species with worldwide distribution International. Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2022, 57: 1925–1932 圖 1: 基于 ITS DNA序列的黑色曲霉 NJ樹 Figure 1: A Neighbor Joining Tree of Black Aspergilli based on Their ITS DNA Sequences. 注：圖片來源于 Reclassification of ATCC174。 PCRSSCP是聚合酶鏈式反應與單鏈 DNA 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術結(jié)合 ， 利用不同構(gòu)象單鏈 DNA 在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中泳動速率的差異 , 檢測出 DNA短片段中存在的單核苷酸突變 ,現(xiàn)已廣泛應用于各種基因多態(tài)性的研究 。觀察菌落直徑、顏色、質(zhì)地、滲出液、菌落反面顏色等特征 。 ? 麥康凱平板： 具中等強度選擇性，抑菌力略強，有較少革蘭陰性菌不生長。 ?在同一個稀釋度的許多平行試管中， 大多數(shù)（一般應超過 95%）表現(xiàn)為不生長。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 微生物純培養(yǎng)分離技術 ?涂布平板法 ?平板劃線法 ?平板傾注法 ?稀釋搖管法 ?液體培養(yǎng)基分離法 ?單細胞（孢子）分離法 ?選擇培養(yǎng)基分離法 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 涂布平板法 少量樣品加到平板中央（ ）； 玻璃三角涂棒浸入酒精； 沾有酒精的涂棒在火焰上灼燒后使其冷卻； 無菌涂棒將樣品均勻涂布瓊脂培養(yǎng)基表面，適當條件下培養(yǎng)。 ? “種” 的定義：一個種（基因型種）是有相似 G+C組成并通過DNA雜交試驗判斷由 70%或更大相似性的菌株的集合。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) ? 液體接種 ? 操作方法與斜面接種基本一致，只是將接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基中時使接種環(huán)與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散； ? 塞上棉塞，輕輕搖動均勻； ? 如果菌種培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中，使用移液管或滴管接種。 曲線法 ： 將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。 ? 個體相對較小的微生物 ，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下用毛細管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個微生物細胞或孢子以獲得純培養(yǎng) 。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 選擇培養(yǎng)基分離 ? 新型 顯色培養(yǎng)基 ? 利用微生物自身代謝產(chǎn)生的 酶與相應顯色底物反應顯色 的原理來檢測微生物的培養(yǎng)基。 用無菌接種針挑取少量培養(yǎng)物，浸入滴有一滴乳酸石炭酸棉藍染色液的載玻片上，用接種針將菌絲團分散開，蓋上蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡），制成水浸片，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征，包括分生孢子梗、分生孢梗莖、頂囊、梗基、瓶梗、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子頭、分生孢子等 。ndor Kocsube180。 ?各類 標準中，其它被指定為參考菌株的黑曲霉菌株 (CMCC(F) 98003) ,需要重新復核鑒定 。 反應程序： 94176。 C保存 。 w: 微弱 (邊界 )生長 。 2:β tubulin gene PCR amplification result. 表 ITS序列特殊位點堿基差異 Table Difference of base position in ITS sequence 堿基位點 Base position 140 166 172 173 Aspergillus brasiliensis IMI 381727 C C T C Aspergillus niger ATCC 16888 A T A A CMCC(F)98003 A T A A 注 : 以 18S和 ITS1區(qū)之間的 TTACCG序列中的第一個 ―C‖為 1位點 . Note: The first C in the border sequence (TTACCG) of 18S and ITS1 is here defined as position 1. 四、微生物鑒定 鑒定實例 2 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 ? ITS rDNA區(qū)序列 分析 以 18S和 ITS1區(qū)之間的TTACCG序列中的第一個 “C”為 1位點 。并對其所負責保藏的菌種均應采取妥善、可靠的 方法保藏 ， 避免 菌種的 污染或死亡 。 ?液面高出斜面頂部 1cm ?4～ 6 ℃ ，干燥處； ?直立放置； ?保藏時間 1 ～ 2年。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 ? 凍干