【正文】 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 不同保藏方法的比較 保藏方法 保藏原理 保藏時(shí)間 保藏設(shè)備 菌種活性 保藏成本 操作性 定期移植法 低溫 (4 ℃ ) 3 ～ 6 月 冰箱 易退化 高 簡(jiǎn)單 液體石蠟法 低溫 (4 ℃ ) 、阻斷氧氣 1 ～ 2 年 冰箱 退化 較高 比較簡(jiǎn)單 真空冷凍干燥法 干燥、低溫、無(wú)氧、保護(hù)劑 8 ～ 10 年 － 80 ℃冰箱、真空冷凍干燥機(jī)、封管設(shè)備 退化 低 復(fù)雜 － 80 ℃冰箱凍結(jié)法 低溫 ( － 80 ℃ ) 、保護(hù)劑 2 ～ 5 年 － 80 ℃冰箱 退化 較低 復(fù)雜 液氮超低溫凍結(jié)法 超低溫 ( － 150 ℃或－ 1 9 6℃ ) 、保護(hù)劑 10 年 以上 程控降溫儀、 液氮運(yùn)輸罐及液氮罐 不易退化 高 復(fù)雜 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 六、質(zhì)控微生物 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 保藏菌株要求 ?藥品微生物檢驗(yàn)用的試驗(yàn)菌應(yīng)來(lái)自認(rèn)可的 國(guó)內(nèi)或國(guó)外菌種收藏機(jī)構(gòu) 的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的 商業(yè)派生菌株 。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 保藏 4～ 6℃ 下避光保藏， 一般可保藏 8～ 10年。 ? 噴碼于安瓿管外， 160℃ 固定 20min。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 液體石蠟法 ? 指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)好后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個(gè)斜面，再直立放置于低溫（ 4～ 6℃ ）干燥處進(jìn)行保存的一種菌種保藏方法。 四、微生物鑒定 鑒定實(shí)例 2 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 五、微生物保藏 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ? 菌種 是進(jìn)行微生物學(xué)研究和應(yīng)用的基本材料，是發(fā)展生物工程的重要基礎(chǔ)條件之一，是國(guó)家的重要生物資源。 2:β 微管蛋白基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果 . Note: M: DL2022 marker。 C: Conidial morphology ( 400). 該菌株的形態(tài)學(xué)特征符合黑曲霉 A. niger的形態(tài)特征 四、微生物鑒定 鑒定實(shí)例 2 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ? Biolog鑒定 注 : ?: 沒(méi)有生長(zhǎng) 。 72176。 Taq DNA聚合酶 ( U/μL) μL。 16404TM and ATCC174。 假絲酵母 PCRSSCP 副溶血弧菌 ERIC－ PCR 沙門氏菌 REP PCR 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 四、微生物鑒定 鑒定實(shí)例 1 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹 infB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 2022年 Aspergillus brasiliensis 2022年 ATCC 16404 鑒定為 Aspergillus brasiliensis . 2022年 USP 將 ATCC 16404 更名 2022年 WDCM 將 ATCC 16404 更名 圖： ATCC 16888和 ATCC 16404的培養(yǎng)特征和顯微形態(tài) a180。 微觀 形態(tài)（細(xì)胞特征） 將培養(yǎng)物在 30℃ 條件下培養(yǎng) 16~24小時(shí)，挑取對(duì)數(shù)期的單菌落，涂布于事先滴加少量無(wú)菌水的載玻片上，自然干燥，加熱固定，進(jìn)行革蘭氏染色，將制好的染色涂片在 100X40倍的顯微鏡下觀察革蘭氏染色情況、菌體形狀、排列行狀、菌體大小 等細(xì)胞特征。 ? SS瓊脂： 有較強(qiáng)的抑菌力，用于志賀菌和沙門菌的分離。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 單細(xì)胞（孢子）分離 ? 單細(xì)胞（或單孢子）分離法是采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 涂布平板法 樣品需適當(dāng)稀釋 30300CFU/mL 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 平板劃線法 ?斜線法 ?曲線法 ?方格法 ?放射法 ?四格法 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 平板劃線法 斜線法： 用接種環(huán)以無(wú)菌操作挑取菌懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線 34條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿 70176。 ? 分類等級(jí) ?界（ Domain） ?門（ Phylum） ?綱（ Class） ?目（ Order） ?科（ Family） ?屬（ Genus） ?種（ Species） 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) ? 微生物接種定義 將微生物的純種或含菌材料（如水、食品、空氣、土壤、排泄物等）轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上，這個(gè)操作過(guò)程叫微生物的接種。 ? 接種工具 ? 微生物接種技術(shù)分類 ? 斜面接種 ? 液體接種 ? 穿刺接種 ? 平板接種 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) ? 斜面接種 ? 左手持菌種管和斜面管，使斜面向上，并盡量放平； ? 右手先將棉塞（硅膠塞）擰轉(zhuǎn)松動(dòng)，再拿接種環(huán)； ? 用右手的小指、無(wú)名指和手掌拔下棉塞并夾緊，同時(shí)將管口在火焰上灼燒； ? 接種環(huán)灼燒滅菌后插入試管內(nèi)，冷卻、挑菌，轉(zhuǎn)入另一斜面底部，沿斜面劃曲線或直線。 角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過(guò)第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過(guò)第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和第四次平行劃線。 ? 較大的微生物 ，可采用毛細(xì)管提取單個(gè)個(gè)體。 ? 堿性瓊脂： 用于從糞便中分離霍亂弧菌及其它弧菌。 培養(yǎng)物 劃線接種于葡萄糖 酵母提取物 蛋白胨固體培養(yǎng)基上， 25℃ 培養(yǎng) 2～ 3 d后 ，取酵母菌制作成水浸片，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 和 無(wú)性繁殖方式 等 。nos Varga, Sa180。 9642TM as Aspergillus brasiliensis. Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter, 2022, Vol. 14 (10): 214 四、微生物鑒定 鑒定實(shí)例 2 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ?各種標(biāo)準(zhǔn)中仍將繼續(xù)采用 ATCC 16404作為質(zhì)控菌株 。 無(wú)菌超純水補(bǔ)足總體積 100 μL。 C 10 min, 4176。 +: 生長(zhǎng)旺盛 。1: ITS rDNA PCR amplification result 。 ? 菌種保藏管理 要求各保藏中心必須具有保藏菌種的詳細(xì)歷史及有關(guān)實(shí)驗(yàn) 資料 。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ? 操作步驟： 液體石蠟預(yù)處理 斜面培養(yǎng)物制備 灌 注 石 蠟 保 藏 ?優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟 ?滅菌： — 121℃ 濕熱滅菌 30min，蒸發(fā)水分； — 160 ℃ 干熱滅菌 2h； ?冷卻至室溫。 ? 滅菌 ? 121 ℃ ， 30min. 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 保護(hù)劑的準(zhǔn)備 ? 保護(hù)劑： 12%脫脂牛奶蒸餾水溶液， 2～ 5ml/管； ? 滅菌鍋加熱至沸騰，將牛奶管放入鍋中， 113℃ 滅菌20min； ? 打開(kāi)放氣閥緩慢排出蒸汽， 取出滅菌后脫脂牛奶試管，迅速放入涼水中冷卻； ? 30℃ 培養(yǎng) 2天，無(wú)菌檢查合格后備用。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 真空冷凍干燥法 ? 保藏、運(yùn)輸方便； ? 保藏時(shí)間長(zhǎng) (5 ～ 10年 )； ? 對(duì)設(shè)備要求高 (真空冷凍干燥機(jī)、多歧管 )，對(duì)人員操作水平要求高； ? 冷凍干燥過(guò)程對(duì)菌體有損傷，需恢復(fù)培養(yǎng)。 92 2022版中國(guó)藥典 《 藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)原則 》 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 國(guó)內(nèi)認(rèn)可的菌種收藏機(jī)構(gòu) ? 1979年 7月，全國(guó)第一屆菌種保藏管理會(huì)議正式成立中國(guó)菌種保藏管理委員會(huì)（ CCCCM），委員會(huì)下設(shè) 7個(gè)全國(guó)性菌種保藏管理中心及機(jī)構(gòu)所在地： ? 普通微生物菌種保藏管理中心（ CCGMC） , 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 ? 農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ ACCC） ,中國(guó)農(nóng)科院區(qū)劃所 ? 工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ CICC），中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院 ? 醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（ CMCC），中國(guó)藥品生物制品鑒定所 ? 抗菌素菌種保藏管理中心（ CACC），中國(guó)醫(yī)科院醫(yī)用生物技術(shù)研究所 ? 獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（ CVCC）