【正文】 培養(yǎng)基上使其直接產(chǎn)生愈傷組織；②在無激素的培養(yǎng)基上發(fā)芽，可產(chǎn)生無菌的根、莖、葉用作外植體；③可直接從種子上剪下根原基及芽尖用作外植體。 外植體切口邊緣開始膨大，外層細(xì)胞通過一分為二的方式進(jìn)行分裂，從而形成一團(tuán)具有分生組織狀態(tài)細(xì)胞的過程。一旦愈傷建立起 來，多數(shù)愈傷系需要每月繼代一次。有時(shí)有些物種的愈傷塊很堅(jiān)硬，接入液體培養(yǎng)基后不能分散，繼代幾次就會(huì)長(zhǎng)出疏松愈傷。可以把愈傷組織分化出芽、根器官概括為以下幾種方式 ⑴單極分化：愈傷組織中的分生中心在刺激物質(zhì)的影響下向著一極分化，形成有根無芽或者有芽無根的現(xiàn)象。同時(shí)，auxion/cytokinin 之比值的變化成為特定的器官、根或芽分化的一個(gè)參數(shù)，一個(gè)基本的規(guī)律是：生長(zhǎng)素促進(jìn)根分化，分裂素促進(jìn)芽分化。 一、植物胚狀體發(fā)生的普遍性 由于培養(yǎng)的植物組織細(xì)胞一般是體細(xì)胞，因而將由離體培養(yǎng)的組織細(xì)胞分化出的胚叫體細(xì)胞胚 (somatic embryo)；又由于離體培養(yǎng)的植物組織細(xì)胞是在未經(jīng)過有性過程的情況下直接產(chǎn)生胚這一結(jié)構(gòu)，并且形成的胚與性細(xì)胞形成的胚相似，因此也將此類胚稱為胚狀體（ embryoid）。胚狀體一旦形成即可長(zhǎng)成為小植株，成苗率高。 其它生長(zhǎng)素如 IAA、 NAA、 NOA、 2， 4， 5T 等的作用與 2， 4D 大致相同，但誘導(dǎo)的效果和對(duì)胚狀體形成的抑制作用不完全一致。 3. 外植體的年齡 (生理狀態(tài) )與來源 少數(shù)植物如胡蘿卜 ,幾乎所有的器官都可誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體 ,但大多數(shù)植物 ,在目前只有一定發(fā)育時(shí)期的某些器官可產(chǎn)生 胚狀體。 2， 4D 對(duì)胚胎發(fā)生很重要，尤其對(duì)禾本科作物。 引言 單倍體細(xì)胞培養(yǎng)主要包括三個(gè)方面：花藥培養(yǎng)、小孢子培養(yǎng)和未受精子房及卵細(xì)胞培養(yǎng)，其中花藥和小孢子培養(yǎng)是體外誘導(dǎo)單倍體的主要途徑。 ② 物理照射和化學(xué)誘變。 2．單倍體的遺傳行為 一倍的單倍體只有一個(gè)染色體基數(shù)（ X），減數(shù)分裂時(shí)染色體不能配對(duì)，分離極不正常，但具有一定同源關(guān)系的染色體可以部分配對(duì)，從而可以對(duì)染色體的演化過程進(jìn)行研究。 （ 3）、花粉發(fā)育時(shí)期： 因 物種而異。 除溫度處理以外，其它一些因素的預(yù)處理有時(shí)也能收效，如用激素處理供體植株可以提高土豆花藥單倍體的形成能力。在大麥和小麥的花藥培養(yǎng)中，谷氨酰胺對(duì)小孢子胚形成具有明顯的促進(jìn)作用。 評(píng)價(jià)花藥培養(yǎng)體系的好壞需要一些技術(shù)指標(biāo)體系，通常使用的有：壓片或切片觀察，計(jì)算啟動(dòng)分裂的小孢子 /總小孢子或計(jì)算愈傷組織塊數(shù)（胚數(shù)、植株數(shù)） /花藥（花蕾）；或一定時(shí)間內(nèi)計(jì)算尚有活力的小孢子數(shù) /總小孢子數(shù)。 (3) 氟樂靈， 是一種植物特異性微管形成抑制劑，也可使染色體加倍 五、花粉（小孢子）培養(yǎng) 花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較 小孢子培養(yǎng)在某些方面比花藥培養(yǎng)有一定優(yōu)勢(shì)： ? 花藥培養(yǎng)有時(shí)會(huì)由于花藥中的有害物質(zhì)而不能誘導(dǎo)小孢子啟動(dòng)第一次分裂，小孢子培養(yǎng)則不存在這一問題； ? 花粉已是單倍體細(xì)胞，誘發(fā)后經(jīng)愈傷組織或胚狀體發(fā)育成的小植株都是單倍體植株或雙單倍體，不含有因藥壁、花絲、藥隔等體細(xì)胞組織的干擾而形成的體細(xì)胞植株； ? 由于起始材料是小孢子，獲得的材料總是純合的，不管它是二倍體還 46 是三倍體； ? 小孢子培養(yǎng)可觀察到由單個(gè)細(xì)胞開始雄核發(fā)育的全過程，是一個(gè)很好的遺傳與發(fā)育研究的材料體系； ? 由于花粉能均勻地接觸化學(xué)的和物理的誘 變因素，花粉是研究吸收、轉(zhuǎn)化和誘變的理想材料。 油菜小孢子培養(yǎng)已經(jīng)成為油菜育種的重要輔助手段，由于小孢子培養(yǎng)群體大，便于選擇，可以有效地縮短育種周期。 酶法可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量 原生質(zhì)體，缺點(diǎn)是：不純的酶制劑所含雜質(zhì)對(duì)原生質(zhì)體可能有不同程度的毒害作用。另一個(gè)分離原生質(zhì)體的常用材料是愈傷組織或懸浮細(xì)胞，采用其作材料可以避免植株生長(zhǎng)環(huán)境的不良影響，可以常年供應(yīng)，易于控制新生細(xì)胞的年齡，處理時(shí)操作方便，無需消毒。 大多數(shù)植物分離原生質(zhì)體時(shí)，纖維素酶濃度在 1%3%，果膠酶在 %1%，但也有很多例外。但酶處理時(shí)間一般不超過 24小時(shí)。m)去掉沒有降解的細(xì)胞及組織 ,收集濾液 . 2. 洗滌 : 將網(wǎng)下物低速離心 ,去掉上清液 ,再加無酶液的 CPW 液懸起原生質(zhì)體 ,再離心 ,棄上清 ,重復(fù)幾次即可 . :采用上浮法和下沉法兩種純化方法。不同的酶需 要的 pH 值不一樣，但 pH 大于 6 時(shí)不利于原生質(zhì)體生存。果膠酶有 Pectolyase Y23 （ Kikkoman Shoyu Co., Lte. Nishinomiya，日本）， Macerozyme（ Yakult Biochemicles Co.，日本）， Pectinase（ Serva）等。 葉肉細(xì)胞是常用的材料 ,因?yàn)槿~片很易獲得而且能充分供應(yīng)。 ? 用作細(xì)胞雜交服務(wù)于作物改良 ? 用作遺傳轉(zhuǎn)化的對(duì)象 ? 研究細(xì)胞壁的發(fā)生過程 ? 篩選突變體 ? 膜的結(jié)構(gòu)、運(yùn)輸、激素接受位點(diǎn)等的研究 ? 用于分離細(xì)胞器和大分子 ? 種質(zhì)資源保存 二、 原生質(zhì)體分離、純化 原生質(zhì)體分離的最基本原則是保證原生質(zhì)體不受傷害及不損害它的再生能力。水稻花培育種最突出的成就是李梅芳等育成的 ―中花 8 號(hào) ‖、 ―中花 9 號(hào) ‖、 ―中花 10 號(hào) ‖、 ―中花 11 號(hào) ‖ 48 粳稻花培新品種，豐產(chǎn)、品質(zhì)好。為了加倍顛茄的單倍體細(xì)胞， Rashid amp。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，球形胚逐漸發(fā)育成心形胚、魚雷形胚等。氮素的量和各種氮素的比例對(duì)培養(yǎng)效果有明顯影響。 （ 4）、 花蕾和花藥的預(yù)處理： 對(duì)于有些物種，培養(yǎng)前對(duì)花藥和花蕾進(jìn)行預(yù)處理，能顯著提高培養(yǎng)效果。對(duì)煙草植株進(jìn)行氮饑餓處理可以提高花藥培養(yǎng)效果。通過篩選可以提高雙生苗的頻率。 40 這一技術(shù)在土豆育種中得到應(yīng)用。分 3 個(gè)部分有 3 個(gè)學(xué)生講述，每個(gè)學(xué)生必須演講 30 分鐘，每個(gè)學(xué)生承擔(dān)一部分：體細(xì)胞無性系變異的概念及其產(chǎn)生的遺傳基礎(chǔ)；無性系變異發(fā)生的普遍性； 無性系變異的育種應(yīng)用。 七、胚胎發(fā)生的分子機(jī)制研究 主要結(jié)合自己的科研結(jié)果講述 , 讓學(xué)生掌握研究分子機(jī)制的意義、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、方法、克隆相關(guān)基因等。不同種的植物甚至同種植物的不同品種 (或不同地理來源 )個(gè)體之間，其個(gè)體基因型存在著差異，這就決定了不同的體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力。不管是那種類型的胚狀體，它都有兩個(gè)特點(diǎn)：①兩極性，即在其發(fā)生的最早階段就具有根端（胚根）和莖端（胚芽）；②它與母體植物或外植體的維管束系統(tǒng)無直接連系。胚狀體是從單細(xì)胞直接分化成小植株，而其它再生植株的方式，一般要經(jīng)過愈傷組織階段，時(shí)間上要慢得多。 溫度：不同植物不一樣，需要摸索，如煙草和棉花就不一樣。 2. 影響器官發(fā)生的因素 ? 化學(xué)因素 : 從早期煙草組織的研究我們知道 ,器官發(fā)生的表達(dá)可被外源化學(xué)物質(zhì)控制 ,高濃度的生長(zhǎng)素和低濃度的分裂素可以促使細(xì)胞連續(xù)繁殖 ——無組織的生長(zhǎng)。 器官發(fā)生： 指從愈傷組織形成芽及根的過程，芽是一個(gè)單極性結(jié)構(gòu)，物理地同母體組織聯(lián)結(jié)著。振蕩速度一般為 30150rpm。 為什么要進(jìn)行繼代培養(yǎng)？ ? 經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)一段時(shí)間后，培養(yǎng)基里的養(yǎng)分耗盡 ? 培養(yǎng)基已干燥 ? 生長(zhǎng)物已充滿培養(yǎng)瓶 ? 培養(yǎng)物需要擴(kuò)繁 ? 瓊脂培養(yǎng)基褐化或發(fā)黑 （因?yàn)橹参锝M織在培養(yǎng)前幾周有時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒素物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)擴(kuò)散進(jìn)入培養(yǎng)基） ? 需要讓培養(yǎng)物在一種新的營養(yǎng)條件下生長(zhǎng) 27 ? 培養(yǎng)基由于植物材料的原因使 pH 降低，導(dǎo)致培養(yǎng)基液化 一般情況下，培養(yǎng)的愈傷組織需要每 4~6 周繼代一次。這時(shí)在外觀上雖然未見明顯變化，但實(shí)際上細(xì)胞內(nèi)一些大分子代謝動(dòng)態(tài)已發(fā)生明顯的改變，細(xì)胞正積極為下一步 分裂進(jìn)行準(zhǔn)備。 或用 %升汞消毒。 植物細(xì)胞全能性 (totipotency)： 植物體細(xì)胞或性細(xì)胞，在人為控制的培養(yǎng)條件下都具有再生成新個(gè)體的潛能，因而在適宜的條件下可以被誘導(dǎo)生長(zhǎng)分化形成完整植株。 三、影響胚珠培養(yǎng)成功的因素 培養(yǎng)基的基本組成 （ 1）培養(yǎng)條件 激素 有機(jī)成分 （ 2）胚的發(fā)育時(shí)期 （ 3）胎座和子房 23 第三節(jié) 胚乳培養(yǎng) 一、胚乳培養(yǎng)的意義 ? 自然條件下，胚乳細(xì)胞以淀粉、蛋白質(zhì)和脂類的形式貯存著大量的營養(yǎng)物質(zhì)，以供胚胎發(fā)育和種子萌發(fā)之需。 光照： 光對(duì)于某些植物胚胎的生長(zhǎng)并不很重要，但對(duì)某些植物胚卻有很大影響。據(jù)報(bào)道，由胚培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織較其它外植體容易得到再生植株。因這種變異類型的種子不能繁殖，故―Makapuno‖十分稀罕，價(jià)格非常昂貴，在菲律賓只有盛大宴會(huì)才供應(yīng)這種果實(shí)。從離體培養(yǎng)胚獲得的幼 20 苗只需 2~3 個(gè)月即可開花，而利用這種花作父本， 1 年內(nèi)可產(chǎn)生 2 個(gè)世代，大大地提高育種進(jìn)程。某些園藝植物如落葉樹的育種和繁育工作因種子休眠期太長(zhǎng)而受到影響。 胚培養(yǎng)的概念： 植物胚胎培養(yǎng)是指使胚及具胚器官（如子房、胚珠）在離體無菌培養(yǎng)條件下發(fā)育成幼苗的技術(shù)。酒精燈在當(dāng)中，右手使用的物品在右側(cè)，左手用品在左側(cè)。 第三節(jié) 離體無菌操作技術(shù) 一、植物材料的消毒 15 接種前必須使材料完全無菌，這是取得植物組織培養(yǎng)成功的根本保證。 2. 培養(yǎng)基的配制 – 稱出規(guī)定數(shù)量的瓊脂和蔗糖，加水直到培養(yǎng)基最終容積的 3/4，在恒溫水浴中加熱使之溶解。配制母液時(shí)應(yīng)注意：分別稱量；充分溶解；注意混合秩序： Ca++應(yīng)最后加入，與 SO42和 HPO42錯(cuò)開，以免產(chǎn)生沉淀；混合時(shí)要緩慢，邊攪拌邊混合。培養(yǎng)基中加入細(xì)胞分裂素，主要是為促進(jìn) 細(xì)胞分裂和由愈傷組織形成器官，分化不定芽。 （ 3）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì) 主要是細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素，有時(shí)也用 GA3。按照國際植 物生理協(xié)會(huì)的建議，植物所需要的濃度大于 ，小于 （ 2）有機(jī)營養(yǎng)成分 11 主要包括碳源（糖類）和維生素類。室內(nèi)設(shè)備：放物臺(tái)、超凈工作臺(tái)、各種接種工具 （ 五）培養(yǎng)設(shè)備 自動(dòng)控溫控光系統(tǒng) 培養(yǎng)室 培養(yǎng)架 搖床 材料培養(yǎng)處 調(diào)溫培養(yǎng)箱 培養(yǎng)箱 調(diào)溫調(diào)濕培養(yǎng)箱 光照培養(yǎng)箱 10 （六）細(xì)胞學(xué)觀察設(shè)備 主要是顯微鏡系統(tǒng)，成像系統(tǒng)等。培養(yǎng)室的主要設(shè)備是培養(yǎng)架、控溫控光系統(tǒng)、搖床等。接種室的主要儀器設(shè)備是 超凈工作臺(tái)和操作臺(tái)（用于放置培養(yǎng)基）。 TAG； Plant Breeding；Euphytica 6 第一章 植物組織培養(yǎng)的原理與方法 學(xué)時(shí)分配 ： 5 學(xué)時(shí) 教學(xué)目的 ： 通過該章教學(xué)，讓學(xué)生掌握 植物組織培養(yǎng)所涉及的基本概念；培養(yǎng)基的組成、特點(diǎn)和用途；植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)；無菌操作的原理與技術(shù)等。 ? 3 基因工程 Geic engineering 細(xì)胞工程 Cell engineering 生物技術(shù) 酶工程 Enzyme engineering 發(fā)酵工程 Fermentation 蛋白質(zhì)工 程 Protein ? 生物技術(shù)的產(chǎn)生： 1953 DNA 雙螺旋的發(fā)現(xiàn)； 60 年代遺傳密碼的全部破譯； 1972 重組 DNA 技術(shù)的建立（生物技術(shù)學(xué)科產(chǎn)生的關(guān)鍵技術(shù)） 介紹重組 DNA 技術(shù)在現(xiàn)代遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物技術(shù)研究中的意義。 植物生物技術(shù)講稿 張 獻(xiàn) 龍 說明 : 植物生物技術(shù)有兩個(gè)課形 : 面向植物科學(xué)技術(shù)專業(yè)的理論課授課為 50 學(xué)時(shí) , 面向其它專業(yè)的理論課授課為 40 學(xué)時(shí)。 二、生物技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展 ? 生物技術(shù)的概念： 生物技術(shù)（ biotechnology），有時(shí)也稱生物工程（ bioengineering），以現(xiàn)代生命科學(xué)技術(shù)成果為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)、改造生物體，生產(chǎn)人類需要的產(chǎn)品。 Developmental Biology。 接種室為密閉式，用紫外線燈進(jìn)行空氣消毒。培養(yǎng)架大小一般為 1200mm 600mm 400mm。 （ 三）化學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)備 主要用于培養(yǎng)基的配制、分裝與滅菌，化學(xué)試劑的配制，蒸溜水的生產(chǎn)，接種材料的準(zhǔn)備、生化分析等 主要設(shè)備有：實(shí)驗(yàn)臺(tái)、水槽、涼干架、冰箱、藥品柜、電爐或