【正文】 有分生組織狀態(tài)細(xì)胞的過(guò)程。 從單個(gè)細(xì)胞或外植體上脫分化形成典型的愈傷組織，大致經(jīng)歷三個(gè)時(shí)期：起動(dòng)期、分裂期和形成期 : 26 起動(dòng)期，又稱為誘導(dǎo)期 ,是愈傷組織形成的起點(diǎn)。種子是誘導(dǎo)愈傷組織的很好的起始材料，因?yàn)椋孩倏蓪⒄７N子放在加有生長(zhǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基上使其直接產(chǎn)生愈傷組織；②在無(wú)激素的培養(yǎng)基上發(fā)芽，可產(chǎn)生無(wú)菌的根、莖、葉用作外植體；③可直接從種子上剪下根原基及芽尖用作外植體。用于培養(yǎng)的外植體包括根、莖、葉、果實(shí)、子房、花粉、花瓣等各種器官或組織。 再分化 （ redifferentiation）： 處于脫分化狀態(tài)的愈傷組織再度分化成類型的細(xì)胞、組織、器官，甚至最終再生成完整的植株過(guò)程。 二、影響胚乳培養(yǎng)的因素 1. 胚乳發(fā)育時(shí)期 思考題： 1． 進(jìn)行胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)各有什么意義或用途？ 24 2． 胚在離體培養(yǎng)條件有有幾種發(fā)育途徑？ 第三章 愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代和培養(yǎng) 教學(xué)時(shí)數(shù)： 5 學(xué)時(shí) 教學(xué)目的： 要求掌握愈傷組織誘導(dǎo)、繼代、培養(yǎng)與分化的基本術(shù)語(yǔ)和概念；掌握器官發(fā)生與體細(xì)胞胚胎發(fā)生的區(qū)別與聯(lián)系；掌握促進(jìn)細(xì)胞分化的方法手段。 ? 胚乳培養(yǎng)作為通過(guò)三倍體而獲得產(chǎn)生無(wú)籽果實(shí)植株的一種手段，倍受國(guó)內(nèi)外果樹育種家重視。 ? 在棉花種間雜交中，通過(guò)胚珠培養(yǎng)可以防止由于棉鈴脫落 喪失雜種胚。 22 第二節(jié) 胚珠培養(yǎng) 一、胚珠培養(yǎng)的用途 ? 成熟胚很小時(shí)，胚培養(yǎng)難以成功，采用胚珠培養(yǎng)較易成功 。不同的植物類型對(duì)其溫度要求也不相同。非常小的幼胚進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，接種后常遇到細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，如不采取一些拯救措施，幼胚細(xì)胞即死亡。 （ 3）產(chǎn)生愈傷組織：幼胚培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞脫分化產(chǎn)生愈傷組織。 二、胚培養(yǎng)技術(shù) 1． 自然條件下胚的發(fā)育 2． 離體培養(yǎng)條件下胚的發(fā)育 3． 胚培養(yǎng)操 作技術(shù) 三、胚培養(yǎng)的影響因素 胚齡 一般說(shuō)來(lái)，胚齡大小與成活率成正相關(guān) 。有一種變異類型，它們的椰子不能形成液體胚乳，取而代之的是一種柔軟肥厚的組織。用胚胎培養(yǎng)可以將不能正常萌發(fā)的種子培養(yǎng)出第二代植物。 ，提高育種效率 在育種實(shí)踐中，為了加快育種進(jìn)程，可采用離體胚 培養(yǎng)的方法。通過(guò)胚的離體培養(yǎng)，可使休眠期縮短 。如果接種的是球形胚，就會(huì)形成很多不正常胚，因?yàn)榕咴叫?，?duì)培養(yǎng)基的成分越敏感；如果接種的是心形或心形期以后的胚，胚的發(fā)育與體內(nèi)發(fā)育相似。 第一節(jié) 胚培養(yǎng) 一、胚培養(yǎng)的意義 克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性和雜種不育性，獲得種間或?qū)匍g雜種 植物胚培養(yǎng)的最大用途是用以獲得種間或?qū)匍g雜種。 17 ? 誘導(dǎo)（ Induction）：體外培養(yǎng)植物材料時(shí)， 細(xì)胞分裂的啟動(dòng)及結(jié)構(gòu)、器官等的誘發(fā) ? 體細(xì)胞克?。河蓡我惑w細(xì)胞形成的細(xì)胞群體 ? 配子細(xì)胞克?。河蓡我慌渥蛹?xì)胞形成的細(xì)胞群體 ? 滅菌與消毒：滅菌（ Sterilization）指消除實(shí)驗(yàn)設(shè)備或材料上的所有微生物；消毒（ Disinfection）：僅指消除可能造成污染或侵染的有機(jī)體。用吸管、注射器進(jìn)行轉(zhuǎn)移液體操作時(shí)，吸管、注射器針頭、不能觸及瓶口以防止細(xì)菌污染或細(xì)胞的交叉污染。但要注意，金屬器械不能在火焰中長(zhǎng)時(shí)間燒灼，以防退火。 對(duì)于難消毒的材料 ,如有茸毛的、粗糙不平的、地下部的等，在消毒前，一般先用肥皂水洗凈，自來(lái)水沖凈，再在 70%酒精或 1N 鹽酸中浸 30’再進(jìn)入消毒劑，消毒劑中可加數(shù)滴吐溫 20，以增強(qiáng)消毒劑 的效果。 – 把培養(yǎng)基分裝到所選用的培養(yǎng)容器中，每個(gè) 25 150mm 的試管約裝培養(yǎng)基 15m1；每個(gè) 150ml 三角瓶約裝 50ml。 – 分別按配方逐個(gè)加入各種貯備液，包括生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他的特殊補(bǔ)加物。 D）有機(jī)化合物母液 主要是維生素和氨基酸類物質(zhì)，這類物質(zhì)不能配成混合母液，一定要分別配成單獨(dú)的母液，濃度為每毫升含 ,1,10mg,使用時(shí)根據(jù)需要量取。 C）鐵鹽母液 必須單獨(dú)配制，若與其它元素混合易造成沉淀。 三、培養(yǎng)基的配制 1. 母液的配制 配制母液有兩個(gè)好處 : 可減少每次配制稱量藥品的麻煩 。細(xì)胞分裂素一般溶于 或 1mol/L 的 HCl 或 NaOH 中。生長(zhǎng)素一般溶于 95%酒精或 的 NaOH 中，后者的溶解效果更好。在離體植物組織培養(yǎng)中，生長(zhǎng)素被用于誘導(dǎo)細(xì)胞分裂和根的分 化。 最常用的碳源是蔗糖，使用濃度為 2%~5%。為了能使組織很好地生長(zhǎng)，在培養(yǎng)基中常常必須補(bǔ)加幾種維生素和氨基酸。其中前 6 種元素需要的數(shù)量較大，因此稱之為大量元素或主要元素。 第二節(jié) 培養(yǎng)基的配制 培養(yǎng)基：含有各種被培養(yǎng)生物材料生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基質(zhì)。此法主要用于不能利用高溫高壓滅菌的培養(yǎng)基成分 滅菌操作： 不能高溫高壓滅菌 的物質(zhì) ： 多糖 Saccharose； Colchicine； Zeatin； GA（ 95%失活）； VB VB1 9 Vc、泛酸； Antibiotics； Plant extracts； Enzymes （ 3）化學(xué)滅菌法 主要用于植物材料的消毒，所用濃度、消毒時(shí)間因不同材料而定，應(yīng)靈活運(yùn)用并不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)。 滅菌操作： 滅菌需要的時(shí)間與物品有關(guān)： 含有 2050ml 培養(yǎng)基的試管或三角瓶， 1210C， 20’ 含有 50500ml 培養(yǎng)基的三角瓶， 1210C， 25’ 含有 5005000ml 培養(yǎng)基的三角瓶， 1210C， 35’ 空試管、瓶、濾紙等， 1210C， 30’ 高溫高壓滅菌后可能會(huì)出現(xiàn)如下問(wèn)題 ,需要引起注意 : 1. pH 值下降 單位 。在培養(yǎng)室內(nèi)應(yīng)設(shè)有若干培養(yǎng)架以放置培養(yǎng)物。 培養(yǎng)室的溫度 7 必須是可控的，一般是用空調(diào)或熱風(fēng)機(jī)使溫度保持在 25177。 接種室 ： 用于植物材料的無(wú)菌操作。 第一節(jié) 植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室建設(shè) 一、植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置 標(biāo)準(zhǔn)的植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室必須具備下列必需的設(shè)施：（ 1）清洗和貯存玻璃器皿 、塑料器皿和其它實(shí)驗(yàn)器皿；（ 2）培養(yǎng)基的配制、滅菌和貯存；（ 3）植物材料的無(wú)菌操作；（ 4）可控溫度、光照、濕度的條件，以便對(duì)材料進(jìn)行體外培養(yǎng)；（ 5）培養(yǎng)物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的顯微觀察 洗滌室： 主要用于清洗各種器皿、培養(yǎng)瓶（皿）的烘干，需要與洗滌有關(guān)的各種小工具、涼干架、烘箱等。 生命科學(xué)研究；科學(xué)導(dǎo)報(bào) ? Trends in Biotechnology； Trends in Plant Science； Trensgenic Research； Plant Cell， Tissue and Organ Culture； Plant Science； In vitro Cellular amp。 植物生物技術(shù)包括： 4 植物組織培養(yǎng)（或細(xì)胞工程） Plant Tissue Culture 基因克隆與轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn) Gene Cloning and Geically Modified Crops （ GM crops） 分子標(biāo)記及輔助育種應(yīng)用 Molecular markers and MAS ? 植物生物技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)：從 “投入特征 ”的作物向 “產(chǎn)出特征 ”的作物轉(zhuǎn)變 ? 植物生物技術(shù)的農(nóng)業(yè)應(yīng)用：創(chuàng)造新材料；培育新品種；開發(fā)功能食品；快速繁殖稀有材料；材料的指紋分析、新基因挖掘、定位、輔助育 種等 五 、植物生物技術(shù)與傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)技術(shù)的關(guān)系 ? 傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中仍將發(fā)揮主導(dǎo)作用，不可用生物技術(shù)全面替代。（三系、兩系、一系，資源挖掘） ? 生物技術(shù)的應(yīng)用（基因革命時(shí)代的到來(lái)）： 20 世紀(jì) 80 年代初轉(zhuǎn)基因作物投入生產(chǎn)標(biāo)志著生物技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的成功應(yīng)用。 2020 年元月 2 緒論 學(xué)時(shí)分配： 1 學(xué)時(shí) 教學(xué)目的：介紹生物技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展，植物生物技術(shù)與農(nóng)業(yè)革命，植物生物技術(shù)在未來(lái)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中所起的作用。本講稿按 50 學(xué)時(shí)編寫，講授 40 學(xué)時(shí)課形時(shí)，根據(jù)教學(xué)大綱取舍。為什么矮桿可以大幅度提高產(chǎn)量？（耐肥，抗倒，增加密度等） ? 雜種優(yōu)勢(shì)利用： 70 年代初，我國(guó)雜交水稻的培育成功，并大面積應(yīng)用于生產(chǎn)，使水稻單產(chǎn)增長(zhǎng) 20%30%，創(chuàng)造了農(nóng)業(yè)奇跡 。 三、轉(zhuǎn)基因作物在全球的應(yīng)用狀況 1． 全球轉(zhuǎn)基因作物的面積分布 2． 發(fā)達(dá)國(guó)家與發(fā)展中國(guó)家的比較 3． 不同作物的應(yīng)用概況 四 、植物生物技術(shù)與應(yīng)用 ? 概念：植物生物技術(shù)（ Plant Biotechnology）是指對(duì)植物品質(zhì)和性狀進(jìn)行改造的生物技術(shù) 。 參考書： ? 植物細(xì)胞組織培養(yǎng)，劉慶昌主編，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社， 2020 ? 作物 DNA 標(biāo)記輔助育種，方宣鈞主編，科學(xué)出版社， 2020 ? 植物基因工程原理與技術(shù)，王關(guān)林主編，最新版？，科學(xué)出版社 ? 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)；科學(xué)通報(bào)；中國(guó)科學(xué) C；植物學(xué)報(bào)；遺傳學(xué)報(bào)；植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)；實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào) 。學(xué)習(xí)后，應(yīng)能獨(dú)立設(shè)計(jì)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，能夠進(jìn)行無(wú)菌操作，能夠獨(dú)立配制培養(yǎng)基。需要試劑瓶、pH 計(jì)、冰箱、天平、微波爐、水浴鍋等。 培養(yǎng)室 ： 培養(yǎng)室是存放接種有植物材料的培養(yǎng)瓶的地方。培養(yǎng)室的濕度應(yīng)控制在相對(duì)濕度 80%左右，當(dāng)培養(yǎng)室的相對(duì)濕度降到 50%以下時(shí)，應(yīng)采取措施增加濕度，以免培養(yǎng)基變干。 二、植物 組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的主要儀器設(shè)備 (一 ) 洗滌設(shè)備 一般應(yīng)有一個(gè)洗滌室 ,專供洗滌及洗凈培養(yǎng)瓶的儲(chǔ)藏 . (二 ) 滅菌設(shè)備 高溫高壓滅菌 物理滅菌 干熱滅菌 射線照射滅菌 過(guò)濾滅菌 熏蒸滅菌 化學(xué)滅菌 消毒液滅菌 (1) 高溫高壓滅菌 原理 : 將待滅菌的物品放在一個(gè)密封的高壓高溫滅菌鍋內(nèi)，在 1210C 高 8 壓和每平方厘米 1 個(gè)大氣壓下，一般持續(xù) 15~20’，就可殺死一切微生物的營(yíng)養(yǎng)體及其 孢子，適于器皿、工具、衣物和培養(yǎng)基滅菌。 4. 揮發(fā)性物質(zhì)不能高溫滅菌 ,否則會(huì)被破壞 . （ 2）過(guò)濾滅菌法 原理： 將帶菌的液體或氣體通過(guò)孔徑小于 微孔濾器裝置 ,使液、氣體通過(guò)濾膜流入無(wú)孔瓶中。 包括倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、研究顯微鏡、體視顯微鏡、 CCD、計(jì)算機(jī)等。植物除了碳（ C）、氫（ H）和氧（ O）外，已知還有 12種元素對(duì)于植物的生長(zhǎng)是必需的，它們是氮 (N)、磷（ P）、硫（ S）、鈣 (Ca)、鉀（ K）、鎂 (Mg)、鐵 (Fe)、錳（ Mn）、銅（ Cu）、鋅、硼（ B）和鋁（ Al）。 雖然大多數(shù)培養(yǎng)物都能合成所有必需的維生素，但合成能力有限，其數(shù)量顯然不足。為了促進(jìn)某些愈傷組織和器官的生長(zhǎng)，有時(shí)還使用很多種化學(xué)成分不明的復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)混合物，如水解酪蛋白，椰子汁，玉米胚乳，麥芽浸出物，番茄汁和酵母浸出物等。 生長(zhǎng)素： 生長(zhǎng)素影響到植物莖和節(jié)間的伸長(zhǎng)、向性、頂端優(yōu)勢(shì)、葉片脫落和生根等現(xiàn)象。 2， 4D 和 2， 4， 5T對(duì)于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)非常有效。比較常用的細(xì)胞分裂素有： BAP（芐氨基嘌呤）、 6—BA（芐基腺膘呤）、 2—ip（異戊烯氨基嘌呤）、 KT（激動(dòng)素，呋喃氨基嘌呤）和 ZT（玉米素）。 N6 主要用于花藥培養(yǎng)，其特點(diǎn)是成分簡(jiǎn)單，且 KNO3 和（ NH4）2SO4 含量高。 B） 微量元素母液 因含量低，一般配成 100 倍甚至 1000 倍，每配 1000ml 培養(yǎng)基取10ml 或 1ml，注意的原則同大量元素。使用螯合鐵的目的：避免沉淀；緩慢不斷地供應(yīng)鐵。在配制液體培養(yǎng)基時(shí)則無(wú)須加熱，因?yàn)檎崽巧踔猎谖氐乃幸部梢匀芙狻Ｒ话銇?lái)說(shuō)，植物組織培養(yǎng)適合的 pH 值為 ，當(dāng) pH 高于 6時(shí)，培養(yǎng)基將會(huì)變硬，低于 5 時(shí)，瓊脂就不能很好地凝固。 取材應(yīng)注意的事項(xiàng)： ,不要有傷口 ,最好中午或下午取材 ,不要在雨天、陰天或露水未干十取材料 ,選用無(wú)菌苗 ,最好將材料種在大棚里 (無(wú)雨水的地方 )或生長(zhǎng)箱