【正文】 LYCOBIOLOGY 六、 糖苷酶的制備方法 ? 黃芪皂苷糖苷酶產(chǎn)生菌的篩選 ? 將篩選用 菌株 Absida sp. A9r 、 A84r 、A9r 、 A8r 、 A38r 、 Arr進(jìn)行培養(yǎng)制備酶液 ? 以黃芪總皂苷為底物進(jìn)行誘導(dǎo) ? 薄層層析法 檢測(cè)水解結(jié)果 。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 七、 糖苷酶的分離、純化和測(cè)定 ? 糖苷酶的分離純化，在原則和技術(shù)方法上和一般的蛋白質(zhì)或酶的分離純化沒(méi)有區(qū)別。釋放出來(lái)的巖藻糖，可以轉(zhuǎn)變?yōu)槿谆杳蜒苌?，氣相色譜上測(cè)定。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 外切糖苷酶的作用特點(diǎn)和底物專(zhuān)一性 ? 糖鏈中糖基的連接順序分析，甲基化反應(yīng)過(guò)碘酸氧化和核磁共振等方法，結(jié)合糖苷酶的逐步水解方法，可提供順序的信息。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 用于糖鏈結(jié)構(gòu)研究的外切糖 苷酶 ? 從肺炎雙球菌的培養(yǎng)液中純化得到 ?半乳糖苷酶，可以水解 Gal?1,4GlcNAc糖苷鍵，但不能水解 ?1,3和 ?1,6鍵，表現(xiàn)出嚴(yán)格的對(duì)取代位置的專(zhuān)一性要求。非還原末端的?甘露糖殘基必需沒(méi)有被其他糖取代。 ? 被酶水解打開(kāi)的糖苷鍵必須是 ?1,4連接。 ? 一種新分離純化的糖苷酶，應(yīng)該用各種常見(jiàn)的糖苷鍵結(jié)構(gòu)類(lèi)型作底物，做一系列酶活性測(cè)定，確定其底物專(zhuān)一性，然后才能用做工具酶。 (1)底物是否充分溶解了 ? ? 有的樣品在水溶液中溶解不好，尤其是糖脂和膜結(jié)合糖蛋會(huì)極大地影響糖苷酶的水解效果。 ? 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)有利于肝癌的早期診斷、鑒別診斷 , 并可作為轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的指標(biāo) ， 也可用于白血病及卵巢癌的診斷。 。 ? 以往主要用于遺傳性 AFU缺乏引起的巖藻糖貯積病的診斷。 ? 可能是另一個(gè)原因，底物結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，造成了分子的空間遮蔽效應(yīng)。 ? 影響糖苷酶測(cè)定結(jié)果的因素很多，大致有以下幾個(gè)方面： TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY (1) 工具酶的選擇 ? 任何一助糖苷酶都可用于糖鏈結(jié)構(gòu)研究的工具酶。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY (3) ? 半乳糖苷內(nèi)切酶 ? 糖基一側(cè)必須是一個(gè)三糖單位，失去非還原末端的半乳糖 乙酰半乳糖胺，都不能成為該酶的底物。 (2)EndoD和 EndoC1的底物專(zhuān)一性完全相同。 ? ?N乙 酰葡糖胺內(nèi)切酶 H(EndoH)的應(yīng)用，在多甘露糖型 N型糖鏈的研究中，收到良好效果。 ? 糖苷酶的使用在糖鏈結(jié)構(gòu)研究主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面： TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY (1)外切糖苷酶的作用特點(diǎn)和底物專(zhuān)一性 ? 通過(guò)糖苷酶水解，能切下非還原末端的一個(gè)單糖，同時(shí)提供關(guān)于糖基的組成、排列順序以及糖苷鍵的 ?或 ?異頭構(gòu)型的信息。 ? 有兩種情況： ? 一是測(cè)定糖苷酶作用下從非還原端釋放的單糖。 ? 方法： 從鮮人參根中提取人參皂苷酶 ， 乙醇沉淀 ，離子交換層析純化 ， 凝膠電泳分析 ， 薄層色譜法測(cè)酶活力。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY Biological Roles of Nglycanase in Cells TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 五、一些常見(jiàn)的 糖苷酶 ? ?D甘露糖苷酶 ? ?D甘露糖苷酶 ? ? D木糖苷酶 ? ?,?鼠李糖苷酶 ? ? D葡萄糖苷酶 ? ?D葡萄糖苷酶： 海藻糖酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡聚糖蔗糖酶、淀粉麥芽糖酶。 ? 一些細(xì)菌、酵母、霉菌的糖苷酶已有相當(dāng)?shù)难芯繄?bào)道。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 第二節(jié) 糖苷酶 ? 糖 苷 酶 (G1ycosidase)是一大類(lèi)催化糖 苷 鍵水 解 的酶 類(lèi)。 ? 目的： 動(dòng)物體內(nèi)研究葡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽疫苗 HDS 免疫原性和防齲效果。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY IPTG 誘導(dǎo)重組 OGT 在 BL 21 大腸桿菌中的表達(dá) TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 大腸桿菌中表達(dá)的重組 OGT 經(jīng) S蛋白質(zhì)凝膠純化 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 研究結(jié)果 ? 在 Hi5 昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的鼠肝 OGT， 經(jīng)鎳離子螯合柱純化后 , 其比活性達(dá)到 nmol ? OGT 基因敲除實(shí)驗(yàn)表明蛋白質(zhì) OGlcNAc 糖基化修飾是胚胎干細(xì)胞存活和個(gè)體發(fā)育所必需的。 ? 將糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞 ， 過(guò)表達(dá)的糖基轉(zhuǎn)移酶使細(xì)胞內(nèi)某些蛋白發(fā)生糖基化 ,產(chǎn)生不同糖型 ， 通過(guò)雙向電泳和凝集素免疫印跡相結(jié)合 ， 比較轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染組糖蛋白改變 ， 從而確定蛋白質(zhì)和糖基化的功能關(guān)系 ,研究 為糖基化改變?cè)诟伟┌l(fā)生中的作用研究奠定了基礎(chǔ)。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基轉(zhuǎn)移酶和疾病 ? 糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)和細(xì)胞周期密切相關(guān)。 ? 血型 A抗原的 GalNAc T和血型 B抗原的 Gal T同源性達(dá) 99％，在 353個(gè)氨基酸殘基中只有 4個(gè)不同。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 不同的糖基轉(zhuǎn)移酶所催化的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)不同 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 人 B血型的 ?13半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)受體底物的專(zhuān)一性 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性 ? 唾液酸化 Lewis X四糖抗原合成時(shí)，一般先生成唾液酸化的 N乙酰乳糖胺，再由 ?1,3Fuc T在 G1cNAc上加入 Fuc，而不能先合成巖藻糖化的 N乙酰乳糖胺后再加上 NeuAc。h) GlcNAc TII GlcNAc TIV GlcNAc TV 腎 1840 ? 330 ? 30 ? 6 腦 660 ? 48 ? 38 ? 1 胃 500 ? 150 ? 25 ? 1 小腸 280 ? 99 17 ? 68 ? 11 肺 104 ? ? 38 ? 4 脾 100 ? 20 ? 8 21 ? 2 睪丸 52 ? ? 37 ? 4 心 11 ? ? 10 ? 1 肝 81 ? ? ? TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 三、糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)域 ? 屬于 II型膜結(jié)合蛋白的糖基轉(zhuǎn)移酶分成四個(gè)結(jié)構(gòu)域。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基轉(zhuǎn)移酶的命名 ? GlcNAc TI的全稱(chēng)為： ? UDPN乙酰葡糖胺 :?3甘露糖基 ?1,2N乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 第八章 糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 第一節(jié) 糖基轉(zhuǎn)移酶(Glycosyltransferases) ? 糖基轉(zhuǎn)移酶是一系列參與催化雙糖、聚糖和糖復(fù)合物中糖鏈合成的一類(lèi)酶。 ? 所有家族只采用兩種折疊方式，形成了兩個(gè)超家族，分別為 GTA