【正文】 沖洗骨髓，沖洗液經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液離心，提取單核細(xì)胞。 結(jié)果： 1．小鼠經(jīng)腹腔注射不同劑量 (80mg/kg， 200mg/kg、 240mg/kg)STZ 誘導(dǎo)糖尿病模型的成功率分別為：0％， ％和 ％； 200mg/kg 和 240mg/kg STZ 腹腔注射組誘導(dǎo)糖尿病模型小鼠實(shí)驗(yàn)觀察期內(nèi)的生存率分別為： ％和 40％。 糖尿病是嚴(yán)重威脅人類生命與健康的全球性多發(fā)病，胰島素替代治療不能阻止其并發(fā)癥的出現(xiàn)，而 β 細(xì)胞替代治療 (包括胰腺移植和胰島細(xì)胞移植 )能達(dá)到生理性調(diào)控胰島素分泌的目的，并維持正常血糖。 3．胰島細(xì)胞提取和純化移植：30只雌 性， 8～ 10 周 SPF 級(jí) Wistar 大鼠，無菌取胰腺并經(jīng)膠原酶適度消化，消化液經(jīng)密度梯度離心分離純化出胰島細(xì)胞。胰島細(xì)胞的純化達(dá)到 80％，存活率為 95％。基于這一理論，建立小鼠糖尿病模型，經(jīng)外周循環(huán)注射負(fù)載供體抗原的小鼠 imDC 誘導(dǎo)異種免疫耐受后，移植大鼠胰島細(xì)胞，觀察糖尿病小鼠移植物存活時(shí)間和移植物排斥反應(yīng)。其中 T1組為糖尿病對(duì)照組，腎被膜下注射等量 RPMI1640 液； T2組為單純胰島細(xì)胞移植組，腎被膜下移植異種胰島細(xì)胞； T3組和 T4 組為經(jīng) imDC 預(yù)處理后異種胰島細(xì)胞移植組，外周靜脈注射供體骨髓細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增的 imDC 后經(jīng)腎被膜下胰島細(xì)胞移植。 2．小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)體外低劑量細(xì)胞因子誘導(dǎo)，可擴(kuò)增分化充足的 imDC。單核細(xì)胞經(jīng)洗滌后置入含 20％胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基中，在 37℃ ， 5％ CO2條件下培養(yǎng)，第 5 天分別加入細(xì)胞因子 IL GMCSF。 2．小鼠骨髓來源細(xì)胞經(jīng)低劑量 GMCSF 聯(lián)合 IL4擴(kuò)增出的細(xì)胞具有典型 DC 的形態(tài)特征，并且高度表達(dá) imDC的表面分子，基本不表達(dá)成熟 DC 的表面分子。如還不能顯示，可以聯(lián)系我 q q 1627550258 ，提供原格式文檔。 3．異種胰島細(xì)胞移植術(shù)前注射 imDC可明顯延長糖尿病小鼠移植術(shù)后血糖濃度維持正常水平的時(shí)間，和單純胰島細(xì)胞移植組相比可明顯減輕移植排斥反應(yīng)，延長移植物存活時(shí)間。監(jiān)測(cè)各組糖尿病小鼠實(shí)驗(yàn)干預(yù)后血糖、體重及皮毛等變化。 方法： 1．不同 STZ 劑量建立糖尿病動(dòng)物模型：將 36只雄性， 6～ 8周 SPF級(jí)的 BALB/c 小鼠完全隨機(jī)分為 G1(對(duì)照組 )、 G G3和 G4組，進(jìn)行糖尿病小鼠建模試驗(yàn)，分別用檸檬酸 檸檬酸鈉緩沖液和 80mg/kg、 200mg/kg、 240mg/kg 三種濃度的 STZ進(jìn)行腹腔注射，監(jiān)測(cè)小鼠血糖濃度，分析建模成功率和生存率，確定最佳建模劑量。 4． T1 組糖尿病小鼠的血糖濃度始終維持在糖尿病水平，體重隨時(shí)間延長而下降，且部分小鼠病程中出現(xiàn)皮毛污穢粘連、高滲性昏迷，感染等表現(xiàn)；T2組小鼠經(jīng)腎被膜下異種胰島細(xì)胞移植后血糖濃度很快恢復(fù)至正常水平，體重上升，但是術(shù)后 5 天血糖開始再次升高，體重隨之下降，表明單純胰島細(xì)胞移植排斥反應(yīng)強(qiáng)烈，胰島細(xì)胞短期內(nèi)失功； T3組和 T4組小鼠經(jīng)外周靜脈注射經(jīng)供體抗原修飾的自身骨髓細(xì)胞培養(yǎng)分化的 imDC后行腎被膜下異種胰島細(xì)胞移植，移植后小鼠血糖濃度在術(shù)后第 2天左右恢復(fù)正常，并且血糖濃度維持在正常水 平的時(shí)間較 T2組明顯延長，體重未見明顯下降。用 DTZ和 AOPI 染色分別鑒定胰島細(xì)胞的形態(tài)和存活率。但是移植物排斥反應(yīng)始終影響移植效果，甚至導(dǎo)致移植胰島失功。 2．小鼠骨髓來源細(xì)胞經(jīng)低劑量 GMCSF 聯(lián)合 IL4擴(kuò)增出的細(xì)胞具有典型 DC 的形態(tài)特征，并且高度表達(dá) imDC的表面分子，基本不表達(dá)成熟 DC 的表面分子。單核細(xì)胞經(jīng)洗滌后置入含 20％胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基中，在 37℃ ， 5％ CO2條件下培養(yǎng)，第 5 天分別加入細(xì)胞因子 IL GMCSF。 2．小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)體外低劑量細(xì)胞因子誘導(dǎo)，可擴(kuò)增分化充足的 imDC。其中 T1組為糖尿病對(duì)照組，腎被膜下注射等量 RPMI1640 液； T2組為單純胰島細(xì)胞移植組，腎被膜下移植異種胰島細(xì)胞； T3組和 T4 組為經(jīng) imDC 預(yù) 處理后異種胰島細(xì)胞移植組，外周靜脈注射供體骨髓細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增的 imDC 后經(jīng)腎被膜下胰島細(xì)胞移植。基于這一理論，建立小鼠糖尿病模型，經(jīng)外周循環(huán)注射負(fù)載供體抗原的小鼠 imDC 誘導(dǎo)異種免疫耐受后，移植大鼠胰島細(xì)胞，觀察糖尿病小鼠移植物存活時(shí)間和移植物排斥反應(yīng)。胰島細(xì)胞的純化達(dá)到 80％，存活率為 95％。 3．胰島細(xì)胞提取和純化移植：30只雌性， 8～ 10 周 SPF 級(jí) Wistar 大鼠，無菌取胰腺并經(jīng)膠原酶適度消化，消化液經(jīng)密度梯度離心分離純化出胰島細(xì)胞。 糖尿病是嚴(yán)重威脅人類生命與健康的全球性多發(fā)病，胰島素替代治療不能阻止其并發(fā)癥的出現(xiàn)，而 β 細(xì)胞替代治療 (包括胰腺移植和胰島細(xì)胞移植 )能達(dá)到生理性調(diào)控胰島素分泌的目的，并維持正常血糖。 結(jié)果： 1．小鼠經(jīng)腹腔注射不同劑量 (80mg/kg， 200mg/kg、 240mg/kg)STZ 誘導(dǎo)糖尿病模型的成功率分別為：0％， ％和 ％； 200mg/kg 和 240mg/kg STZ 腹腔注射組誘導(dǎo)糖尿病模型小鼠實(shí)驗(yàn)觀察期內(nèi)的生存率分別為： ％和 40％。 2． imDC 提取和培養(yǎng)：將 20只雄性， 6～ 8周 SPF級(jí)的 BALB/c 小鼠，取股骨、脛骨沖洗骨髓，沖洗液經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液離心，提取單核細(xì)胞。 結(jié)論： 1．一次性腹腔注射STZ200mg/kg 誘導(dǎo) BALB/c 小鼠的糖尿病模型成功率和生存率明顯優(yōu)于STZ80mg/kg 和 STZ240mg/kg 注射組。 4． imDC 預(yù)處理和胰島細(xì)胞移植：將 40 只 BALB/c 小鼠完全隨機(jī)分為 T T T T4組，建立糖尿病模型。樹突狀細(xì)胞 (dendritic cell， DC)的外周致耐受作用通常由未成熟樹突狀細(xì)胞 (immature dendritic cell， imDC)介導(dǎo)，由于 imDC不表達(dá)共刺激分子，當(dāng) imDC 攜帶自身抗原移行至外周淋巴組織后不能使 T細(xì)胞活化，從而誘導(dǎo) T 細(xì)胞無能，導(dǎo)致自身耐受。 3．每只 Wistar 大鼠胰腺可分離純化出胰島細(xì)胞約 個(gè)。第 7天收取貼壁細(xì)胞，標(biāo)定單克隆抗體，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞數(shù)量及 imDC 比例。 3．異種胰島細(xì)胞移植術(shù)前注射 imDC可明顯延長糖尿病小鼠移植術(shù)后血糖濃度維持正常水平的時(shí)間，和單純胰島細(xì)胞移植組相比可明顯減輕移植排斥反應(yīng)，延長移植 物存活時(shí)間。監(jiān)測(cè)各組糖尿病小鼠實(shí)驗(yàn)干預(yù)后血糖、體重及皮毛等變化。 方法： 1．不同 STZ 劑量建立糖尿病動(dòng)物模型：將 36只雄性， 6～ 8周 SPF級(jí)的 BALB/c 小鼠完全隨機(jī)分為 G1(對(duì)照組 )、 G G3和 G4組，進(jìn)行糖尿病小鼠建模試驗(yàn)，分別用檸檬酸 檸檬酸鈉緩沖液和 80mg/kg、 200mg/kg、 240mg/kg三種濃度的 STZ進(jìn)行腹腔注射，監(jiān)測(cè)小鼠血糖濃度，分析建模成功率和生存率，確定最佳建模劑量。 4． T1 組糖尿病小鼠的血糖濃度始終維持在糖尿病水平，體重隨時(shí)間延長而下降，且部分小鼠病程中出現(xiàn)皮毛污穢粘連、高滲性昏迷，感染等表現(xiàn)； T2組小鼠經(jīng)腎被膜下異種胰島細(xì)胞移植后血糖濃度很快恢復(fù)至正常水平，體重上升，但是術(shù)后 5 天血糖開始再次升高，體重隨之下降，表明單純胰島細(xì)胞移植排斥反應(yīng)強(qiáng)烈，胰島細(xì)胞短期內(nèi)失功； T3組和 T4 組小 鼠經(jīng)外周靜脈注射經(jīng)供體抗原修飾的自身骨髓細(xì)胞培養(yǎng)分化的 imDC 后行腎被膜下異種胰島細(xì)胞移植，移植后小鼠血糖濃度在術(shù)后第 2天左右恢復(fù)正常，并且血糖濃度維持在正常水平的時(shí)間較 T2組明顯延長，體重未見明顯下降。用 DTZ 和 AOPI染色分別鑒定胰島細(xì)胞的形態(tài)和存活率。但是移植物排斥反應(yīng)始終影響移植效果，甚至導(dǎo)致移植胰島失功。 2．小鼠骨髓來源細(xì)胞 經(jīng)低劑量 GMCSF 聯(lián)合 IL4擴(kuò)增出的細(xì)胞具有典型 DC的形態(tài)特征，并且高度表達(dá) imDC的表面分子，基本不表達(dá)成熟 DC的表面分子。單核細(xì)胞經(jīng)洗滌后置入含 20％胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基中，在 37℃ ， 5％ CO2條件下培養(yǎng)，第 5 天分別加入細(xì)胞因子 IL GMCSF。但是移植物排斥反應(yīng)始終影響移植效果，甚至導(dǎo)致移植胰島失功。用 DTZ和 AOPI染色分別鑒定胰島細(xì)胞的形態(tài)和存活率。 4． T1 組糖尿病小鼠的血糖濃度始終維持在糖尿病水平，體重隨時(shí)間延長而下降，且部分小鼠病程中出現(xiàn)皮毛污穢粘連、高滲性昏迷，感染等表現(xiàn)； T2組小鼠經(jīng)腎被膜下異種胰島細(xì)胞移植后血糖濃度很快恢復(fù)至正常水平，體重上升，但是術(shù)后 5 天血糖開始再次升高，體重隨之下降，表明單純胰 島細(xì)胞移植排斥反應(yīng)強(qiáng)烈，胰島細(xì)胞短期內(nèi)失功； T3組和 T4 組小鼠經(jīng)外周靜脈注射經(jīng)供體抗原修飾的自身骨髓細(xì)胞培養(yǎng)分化的 imDC 后行腎被膜下異種胰島細(xì)胞移植，移植后小鼠血糖濃度在術(shù)后第 2天左右恢復(fù)正常，并且血糖濃度維持在正常水平的時(shí)間較 T2組明顯延長，體重未見明顯下降。 方法： 1．不同 STZ 劑量建立糖尿病動(dòng)物模型：將 36 只雄性， 6～ 8周 SPF級(jí)的 BALB/c小鼠完全隨機(jī)分為 G1(對(duì)照組 )、 G G3 和 G4 組，進(jìn)行糖尿病小鼠建模 試驗(yàn)，分別用檸檬酸 檸檬酸鈉緩沖液和 80mg/kg、 200mg/kg、 240mg/kg 三種濃度的 STZ進(jìn)行腹腔注射，監(jiān)測(cè)小鼠血糖濃度，分析建模成功率和生存率，確定最佳建模劑量。監(jiān)測(cè)各組糖尿病小鼠實(shí)驗(yàn)干預(yù)后血糖、體重及皮毛等變化。 3．異種胰島細(xì)胞移植術(shù)前注射 imDC 可明顯延長糖尿病小鼠移植術(shù)后 血糖濃度維持正常水平的時(shí)間，和單純胰島細(xì)胞移植組相比可明顯減輕移植排斥反應(yīng)，延長移植物存活時(shí)間。第 7天收取貼壁細(xì)胞，標(biāo)定單克隆抗體，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞數(shù)量及 imDC 比例。 3．每只 Wistar 大鼠胰腺可分離純化出胰島細(xì)胞約 個(gè)。樹突狀細(xì)胞 (dendritic cell， DC)的外周致耐受作用通常由未成熟樹突狀細(xì)胞 (immature dendritic cell， imDC)介導(dǎo)，由于 imDC不表達(dá)共刺激分子，當(dāng) imDC 攜帶自身