【正文】 iaBertani)培養(yǎng)基 蛋白胨 (Tryptone) 10 g 酵母提取物 (Yeast extract) 5 g 氯化鈉 (NaCl) 10 g 于 1000 mL 雙蒸水中溶解， 121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min， 4℃保存待用。 sf9細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 使用 Grace’ s Insect Cell Medium加血清及雙抗的培養(yǎng)基，在 28℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng) sf9 細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長至 80%左右，直接將細(xì)胞輕輕吹起，每兩天左右 1 比 3 傳代一次。 Primer Star是一種高保真的 DNA聚合酶，可以一定程度上減少因 PCR擴(kuò)增帶來的 SNP。加入 700ml Washing Buffer（已加乙醇）， 10000g 1min 離心。 轉(zhuǎn)化用 DH5α 感受態(tài)的制備 制備感受態(tài)前將實(shí)驗(yàn)室中保存的 DH5α 接種到 5 mL LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 12 小時(shí)。第二天轉(zhuǎn)化，第三天挑斑，通過 PCR鑒定和酶切鑒定后得到陽性克隆。 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 20xx屆本科畢業(yè)論文 11 2） 圖中 Rep 為實(shí)驗(yàn)后續(xù)階段感興趣的需要光控表達(dá)的目的基因，之所以先用其替換 mCherry，再用 mCherry 替換回來，是因?yàn)?mCherry 中含有一個(gè)PvuII 酶切位點(diǎn)，這會對下一步將 GFPEL222 片段克隆進(jìn)載體造成 不便， 故 采取這個(gè)迂回措施。 3） 稀釋 8μl轉(zhuǎn)染試劑（ Cellfectin174。藍(lán)光照射條件為：照射 10s、黑暗 10s 為一個(gè)循環(huán)。 1） ①號質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 sf9 后，設(shè)置藍(lán)光照射與黑暗條件培養(yǎng)兩組，轉(zhuǎn)染 24 小時(shí)后施與光照（藍(lán)光照射 10s停 10s為一個(gè)循環(huán)）與黑暗兩種條件，光照 24小時(shí)后于熒光顯微鏡下觀察，得到結(jié)果（圖 5(a)）。 初步分析，該系統(tǒng)工作效率低的原因可能 VPEL222 蛋白的表達(dá)并不如預(yù)期。 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 20xx屆本科畢業(yè)論文 15 參考文獻(xiàn) 1 Weber, W. amp。 Dolmetsch, . Induction of proteinprotein interactions in live cells using light. Nat. Biotechnol. 27, 941– 945 (20xx). 10 Nash, . et al. Structural basis of photosensitivity in a bacterial lightoxygenvoltage/helixturnhelix (LOVHTH) DNAbinding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 9449– 9454 (20xx). 11 1Huala, E. et al. Arabidopsis NPH1— a protein kinase with a putative redoxsensing domain. Science 278, 2120– 2123 (1997). 12 RiveraCancel, G., MottaMena, . amp。養(yǎng)育之恩，無以回報(bào)，感謝父母給與我學(xué)業(yè)的大力支持，他們的理解與支持是我勇于追求、不斷前進(jìn)的源泉和動力，使我能夠全心投入工作，完成學(xué)業(yè)。再次向徐老師、何老師、吳師兄表達(dá)最真摯的感謝！ 剛剛進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，得到了王華東師兄、賈凡師兄、阮世龍師兄、林坤章師兄、高娟師姐、丁婷師姐等在實(shí)驗(yàn)技術(shù)上的耐心指導(dǎo)；幾個(gè)月的相處，從與師兄師姐們的交流中獲益匪淺，在此，我向他們表達(dá)最誠摯的謝意。 Gersbach, . Lightinducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J. Am. Chem. Soc. 134, 16480– 16483 (20xx). 7 ShimizuSato, S., Huq, E., Tepperman, . amp。當(dāng)采用 western blot 實(shí)驗(yàn)或其它分子生物學(xué)方法證實(shí) EL222 蛋白的表達(dá)量足夠時(shí)，這一猜想將被證實(shí)。 從圖 5(c)中可以看出，藍(lán)光額外照射 24h 會略微增加紅色熒光細(xì)胞的數(shù)量，但增加不是很明顯。 圖 。根據(jù)不同需求，給予培養(yǎng)細(xì)胞不同的光照條件。平板培養(yǎng)基中不可有 抗生素 。⑥克隆方法同上，使用的酶切位點(diǎn)為 AgeI和 SpeI。 DNA的非柱回收簡單純化步驟 1） DNA溶液中中加入 1/10體積的 3M乙酸鈉或 2M氯化鈉或 5M醋酸銨 ； 2） 加入 （或的體積的異丙醇），混合均勻，于 20℃放置半小時(shí) ； 3） 10000g離心 1015分鐘，去上清 ； 4） 用預(yù)冷的 70％乙醇漂洗后風(fēng)干 ； 5） 加入 ddH2O 溶解。 載體片段連接體系： 載體 150ng 片段 100ng T4 ligase（ 10u/μL） T4 ligase Buffer（ 10x） 1μl ddH2O Total 10μl 16℃連接過夜后，將產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化。將已經(jīng)溶好的膠加入提供的柱子中， 10000g 1min 離心。對于菌液 PCR，可以適當(dāng)減少兩個(gè)循環(huán)，以避免非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)。 VI、感受態(tài)制備所用溶液 TSS緩沖液（ 1） PEG8000 g DMSO mL MgCl2 g 用稱取好上述試劑后，加到 5 mL LB 培養(yǎng)基中充分溶解，過濾除菌后儲存在 4℃冰箱。因此這篇文章作為先導(dǎo)文章，通篇并不涉及該光控表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)際應(yīng)用，只是為后面能深入應(yīng)用該系統(tǒng)做鋪墊。 當(dāng)前應(yīng)用較廣的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)使用較為成熟，它的優(yōu)點(diǎn)已有目共矚。（ b）轉(zhuǎn)染 pC120mCherry后的293T野生型細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá) VPEL222蛋白的細(xì)胞在光照黑暗兩種條件處理后的熒光顯微鏡下的圖像。最后，在斑馬魚中已證明不論是全身還是組織特異性的基因都適用利用 EL222 來實(shí)現(xiàn)最低毒性的光控表達(dá)，擴(kuò)大了這個(gè)表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用范基 于 sf9細(xì)胞的藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 4 圍。在 EL222 原始宿主中，發(fā)現(xiàn)這個(gè)基因的光依賴激活作用與基因組上的 EL222結(jié)合位點(diǎn)毗鄰， 暗示這個(gè)蛋白質(zhì)是一個(gè)光敏轉(zhuǎn)錄因子。 7， 8， 9 VPEL222轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng) EL222 轉(zhuǎn)錄因子，最初源于一個(gè)細(xì)菌的光 氧 壓蛋白 10，被藍(lán)光照射時(shí)就會二聚化結(jié)合到 DNA 上。首先是敏捷度高，從接受刺激到產(chǎn)生效果只需要很短的時(shí)間，而當(dāng)誘導(dǎo)物是其它物質(zhì)時(shí)，從接受刺激到產(chǎn)生效果很大程度上受限于化學(xué)分子的擴(kuò)散速率，而擴(kuò)散速率由于很多其它因素有關(guān)，諸如溫度、分子大小等，這些因素的存在使得實(shí)驗(yàn)條件不易精確 控制。當(dāng)誘導(dǎo)物不存在時(shí)，激活蛋白與阻遏蛋白結(jié) 合，基因正常轉(zhuǎn)錄；添加誘導(dǎo)物后，誘導(dǎo)物與激活蛋白結(jié)合或阻止其與阻遏蛋白結(jié)合，阻遏蛋白則與啟動子上的某些順式作用元件結(jié)合，抑制 基因轉(zhuǎn)錄，如以四環(huán)素抑制子為基礎(chǔ)的四環(huán)素抑制系統(tǒng) (tTA)。人工構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)以滿足不同需求。 2) Able to be modified after translation processing ,including: glycosylation, phosphorylation, amidation and signal peptide cutting etc., to make the rebinant protein more close to natural protein on the structure and function。 該系統(tǒng)當(dāng)前已有實(shí)驗(yàn)證明在 293細(xì)胞中發(fā)揮作用，且效果良好，我們計(jì)劃把它引入到 sf9昆蟲細(xì)胞中。桿狀病毒是一類以昆蟲細(xì)胞為天然宿主的雙鏈 DNA病毒，具有高度的種屬特異性，不感染脊椎動物，對人畜無害。這一方法對在時(shí)空上精確控制基因表達(dá)是一個(gè)強(qiáng)大的工具。武漢 二〇一 五 年 六 月 華中農(nóng) 業(yè)大學(xué) 學(xué) 士學(xué)位論文 基于 sf9昆蟲 細(xì)胞的 藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 Construction of Bluray Induced Expression System in sf9 insect Cells 學(xué)生姓名 : 蔡澤蘄 學(xué)生學(xué)號 : 20xx30420xx07 學(xué)生專業(yè) : 生物學(xué)基地班 指導(dǎo)教師 : 徐富強(qiáng) 教 授 指導(dǎo)小組 : 吳 陽 博后 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 二 〇 一 五 年六 月 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 20xx屆本科畢業(yè)論文 目錄 摘 要 ..................................................................................................................................... I Abstract .............................................................................................................................. III 縮略詞表 ............................................................................................................................ IV 1 前言 ................................................................................................................................... 1 誘導(dǎo)型啟動子 ........................................................................................................ 1 ..................................................................................... 1 ..................................................................................... 1 光誘導(dǎo)啟動子 ............................................................................................. 2 VPEL222轉(zhuǎn)錄激活系 統(tǒng) ..................................................................................... 3 VPEL222系統(tǒng)在 293T細(xì)胞中的表現(xiàn) ............................................................... 4 p