【正文】 焉得諼草，言樹之背。 Quail, . A lightswitchable gene promoter system. Nat. Biotechnol. 20, 1041– 1044 (20xx). 8 Levskaya, A. et al. Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light. Nature 438, 441– 442 (20xx) 9 Yazawa, M., Sadaghiani, ., Hsueh, B. amp。 雖然該系統(tǒng)在 sf9細(xì)胞中的初次實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)不 是很理想，但此次實(shí)驗(yàn)的一個(gè)重大成果是證明了 VPEL222光控表達(dá)系統(tǒng)能夠在 sf9昆蟲細(xì)胞中工作（即是工作效率不高，仍具有借鑒意義）。 圖 5(b)中， 沒有 EL222 的陰性對(duì)照和黑暗條件下的對(duì)照基本符合預(yù)期 ，泄露表達(dá)情況很微弱 。 分別轉(zhuǎn)染 pMIBC120mCherryGFPEL222 質(zhì)粒（ 圖 5 中簡(jiǎn)稱為①號(hào)質(zhì)粒）和 pMIBC120mCherryGFP 質(zhì)粒（圖 5 中簡(jiǎn)稱為②號(hào)質(zhì)粒）于 sf9 細(xì)胞中， 28℃孵育 24h，再施與光照與黑暗兩種條件， 24h 和 48h 后在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光分布情況（圖 5）。 本次一共設(shè)計(jì)了四組轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染①號(hào)質(zhì)粒的光照與黑暗兩組，轉(zhuǎn)染②號(hào)質(zhì)粒的光照與黑暗兩組。 2） 放置待轉(zhuǎn)染的 sf9 細(xì)胞與超凈臺(tái)上 15min，吸除平板中的培養(yǎng)基，加入。⑦直接使用 BsiwI酶對(duì)載體進(jìn)行單切并電泳回收，純化后直接自連。 1） 圖 3 中，各步詳細(xì)步驟如下：①設(shè)計(jì) mCherry 的引物 ，使兩端分別帶有 AgeI 和 SpeI 酶切位點(diǎn)， PCR回收后，同時(shí)對(duì)載體 pMIB和 mCherry進(jìn)行雙酶切（ SpeI/AgeI） 2小時(shí)，并通過柱回收方式純化酶切產(chǎn)物，然后用 T4 連接酶連接過夜。有時(shí)候在連接之前（主要是指單酶切的連接反應(yīng)），需要對(duì)載體進(jìn)行去磷酸化，去磷酸化反應(yīng)如下： 載體 150ng CIP（ 10/μl） Cutsmart（ 10x) 1μl ddH2O Total 10μl 去磷酸化反應(yīng)在 37℃處理 30min即可。去除濾液，加入 500ml Binding Buffer 再次 10000g 1min離心，去濾液； 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 20xx屆本科畢業(yè)論文 9 4） 洗柱子。 對(duì)于需要回收后產(chǎn)物的 PCR反應(yīng)，我們使 用 Primer Star代替 EasyTaq，對(duì)應(yīng)的 Buffer也跟著換，程序中變性溫度提高到 98℃。 VII、 sf9細(xì)胞培養(yǎng)液（ 50ml體系） Grace’ s Medium 44ml 胎牛血清 FBS 5ml 雙抗 1ml Total 50ml 注：雙抗指兩種抗生素：青霉素和鏈霉素。 實(shí)驗(yàn)材料 材料與試劑 pMIB/v5his載體 Invitrogen公司 Gel Extraction kit膠回收試劑盒 OMEGA biotek公司 Plasmid mini kit質(zhì)粒回收試劑盒 OMEGA biotek公司 DH5α感受態(tài) ATCC 限制性內(nèi)切酶 NEB公司 Sf9昆蟲細(xì)胞 Invitrogen公司 胎牛血清 FBS GIBCO 公司 Cellfectin174。但用作某些特定需求的基礎(chǔ)研究則會(huì)顯得力不從心，如當(dāng)需要對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行實(shí)時(shí)控制時(shí)。 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 20xx屆本科畢業(yè)論文 5 pMIB/V5His載體 pMIB/V5His 載體分 A、 B、 C 三型，這次實(shí)驗(yàn)中使用的是 A 型，從Invitrogen公司購(gòu)買?？傊?，已掌握的資料和數(shù)據(jù)突出了 EL222 系統(tǒng)寬廣的通用性以及它作為光遺傳學(xué)工具的優(yōu)勢(shì)。 對(duì) EL222 機(jī)制的理解使我們能夠在單一蛋白質(zhì)復(fù)合系統(tǒng)中使用光依賴基因激活作用。這個(gè)系統(tǒng)對(duì)控制表達(dá)的目標(biāo)蛋白有足夠大的的可調(diào)表達(dá)范圍，敏捷的激活和去激活作用，以及對(duì)光強(qiáng)足夠高的線性相關(guān)性。再者光在某種程度上是完全無毒的 對(duì)細(xì)胞中其它的生化反應(yīng)無任何影響的條件，這是非光誘導(dǎo)因子所不能做到的，光的激活和去激活作用完成一個(gè)循環(huán)后在細(xì)胞中可以做到零殘留，這使得實(shí)驗(yàn)條件控制更加理想化，少了一個(gè)不可控的變量 5， 6。 Love 等用包含四環(huán)素抑制子的啟動(dòng)子 Topl0 與報(bào)告基因 GFP 相連轉(zhuǎn)化擬南芥，發(fā)現(xiàn) 用 100 ng/mL 的四環(huán)素即可抑制 GFP 的表達(dá)，而且改變培養(yǎng)基中四環(huán)素的濃度，可調(diào)節(jié) GFP的表達(dá)水平。目前研究最多、最深 入的可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)是化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。 3) Expressing the foreign protein efficiently, 50% of total 基 于 sf9細(xì)胞的藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 IV amount of protein level in a cell。我們的主要工作是構(gòu)建承載該系統(tǒng)的質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞，獲得報(bào)告基因的表達(dá)情況。目前研究較多的是苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒 (AcMNPV)。 本文將講述這個(gè)新的光控表達(dá)系統(tǒng)在 sf9昆蟲細(xì)胞蛋白表達(dá)中的應(yīng)用。 本科畢業(yè)論文 (設(shè)計(jì) ) 題 目 基于 sf9昆蟲 細(xì)胞的藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 Construction of Bluray Induced Expression System in sf9 insect Cells 姓 名 蔡澤蘄 學(xué) 號(hào) 20xx30420xx07 學(xué) 院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 專業(yè)班級(jí) 生科 1101 指導(dǎo)教師 徐富強(qiáng) 職 稱 研究員 中國(guó) Sf9昆蟲細(xì)胞即草地貪夜蛾細(xì)胞。 而我們用 來構(gòu)建的這個(gè)光控表達(dá)系統(tǒng)所使用的載體 pMIB/v5his中的 OpIE1和 OpIE2正是一個(gè)桿狀病毒的早期啟動(dòng)子，其中后者是比前者更強(qiáng)的啟動(dòng)子。 在引入這個(gè)系統(tǒng)之前我們需要對(duì)其進(jìn)行定性測(cè)試，采取的 方法是用紅色熒光蛋白基因 mCherry作為報(bào)告基因，通過 mCherry的表達(dá)情況大致了解這個(gè)光控系統(tǒng)的運(yùn)作行為。 4) Able to acmodate large fragment exogenous gene. Currently existing experiment proves that this system play a role in 293 cells, and the result is very we plan to introduce it to the sf9 insect cells. Our main work is to build a carrying plasmid of the system, then to transfect sf9 cell, getting the data of the expression level of reporter gene . Before introducing this system we need to carry on the qualitative test, mCherry gene which is a red fluorescent protein gene is made to be the reporter gene, through the expression of which we can learn the effect of the optogeic gene expression system in sf9 cell. This paper is mainly about the exploration of the system . As a manual control gene expression system,this system is one of the most promising system of the the grate advantages , it is expected to play a role in basic life science field, and the application of it here is only a small application is never limited to the insect cells, also functional in many vertebrates cell. This assay to apply the system in sf9 cells is the first time in the word. Keywords: Baculovirus Expression Vector, Optical expression system, insect cells . 縮略詞表 Amp Ampicillin 氨芐青霉素 LB LuriaBertani culture medium LB 培養(yǎng)基 FBS Fetal bovine serum 胎牛血清 PCR polymerase chain reaction 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) GFP Green Fluorescent Protein 綠色熒光蛋白 BEV Baculovirus Expression Vector 桿狀病毒表達(dá)載體 SNP Single Nucleotide Polymorphisms 單核苷酸的多態(tài)性 SM Streptomycin 鏈霉素 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 20xx屆本科畢業(yè)論文 1 1 前言 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 天然誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 (inducible promoter)是指自然界天然存在的在某些特定的物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下，該 種類型的啟動(dòng)子可以大幅度地提高 基因 的轉(zhuǎn)錄水平。自第一次用化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng) TetR，通過 CaMV35S 啟動(dòng)子成功調(diào)節(jié) cat基因的表達(dá)以來已有 20 多年的 歷史，現(xiàn)已發(fā)展成日臻完善的植物表達(dá)外源基因的可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。 2）激活型啟動(dòng)子系統(tǒng) 在抑制型啟動(dòng)子系統(tǒng)中，抑制基因轉(zhuǎn)錄所需誘導(dǎo)物的量往往超出植物適應(yīng)的范圍，而且在真核生物中激活基因比 抑制基因轉(zhuǎn)錄更容易，近年發(fā)展了一些激活型啟動(dòng)子系統(tǒng)，如地塞米松誘導(dǎo)的 GR 系統(tǒng)、雌二醇誘導(dǎo)的 ER 系統(tǒng)、殺蟲劑誘導(dǎo)的 EcR 系統(tǒng)等。另外，對(duì)于精確度的掌握，光的劑量控制顯然比化學(xué)物質(zhì)的劑量控制更方便也更科學(xué)。通過這個(gè)系統(tǒng)，已在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中測(cè)試了光控轉(zhuǎn)錄作用。在這里我們將報(bào)告一個(gè)經(jīng)過基因工程改造的 EL222。 VPEL222系統(tǒng)在 293T細(xì)胞中的表現(xiàn) 此系統(tǒng)由 Laura B MottaMena等最先從 293T細(xì)胞中發(fā)展而來 14，在推廣該系統(tǒng)前，已經(jīng)做了大量的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。該載體主要用于帥選被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以及用于在鱗翅類昆蟲細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白。前者在某種程度上更加類似于化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)，至于化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子和光誘導(dǎo)系統(tǒng)的優(yōu)劣比較，前面已有詳述，此處不再贅述。Ⅱ Reagent 轉(zhuǎn)染試劑 Invitrogen 公司 Grace’ s Insect Cell Medium GIBCO 公司 CIP NEB公司 I、培養(yǎng)基 1） LB (Lur