【正文】 學 20xx屆本科畢業(yè)論文 1 1 前言 誘導型啟動子 天然誘導型啟動子 (inducible promoter)是指自然界天然存在的在某些特定的物理或化學信號的刺激下，該 種類型的啟動子可以大幅度地提高 基因 的轉(zhuǎn)錄水平。 關鍵詞：桿狀病毒表達載體、光控表達系統(tǒng)、昆蟲細胞 。 在引入這個系統(tǒng)之前我們需要對其進行定性測試，采取的 方法是用紅色熒光蛋白基因 mCherry作為報告基因，通過 mCherry的表達情況大致了解這個光控系統(tǒng)的運作行為。因此從某種程度上說，桿狀病毒表達載體所具有的優(yōu)點，我們使用的 pMIB載體也同樣具有。 而我們用 來構(gòu)建的這個光控表達系統(tǒng)所使用的載體 pMIB/v5his中的 OpIE1和 OpIE2正是一個桿狀病毒的早期啟動子，其中后者是比前者更強的啟動子。 Sf9昆蟲細胞是桿狀病毒表達系統(tǒng)的平臺。 Sf9昆蟲細胞即草地貪夜蛾細胞。在我們這里將展示一個新的光控表達系統(tǒng)，它沒有前述三大缺點，且已被證明廣泛的適用性。 本科畢業(yè)論文 (設計 ) 題 目 基于 sf9昆蟲 細胞的藍光誘導表達系統(tǒng)的構(gòu)建 Construction of Bluray Induced Expression System in sf9 insect Cells 姓 名 蔡澤蘄 學 號 20xx30420xx07 學 院 生命科學技術(shù)學院 專業(yè)班級 生科 1101 指導教師 徐富強 職 稱 研究員 中國盡管如此，當前主要的光控表達系統(tǒng)仍有很多弱點限制著它的應用，比如：蛋白本身的毒性、狹窄的調(diào)控范圍以及反應緩慢的激活和去激活作用，相比傳統(tǒng)的化學誘導表達系統(tǒng) 沒有壓倒性優(yōu)勢。 本文將講述這個新的光控表達系統(tǒng)在 sf9昆蟲細胞蛋白表達中的應用。 sf9細胞屬于半貼壁型細胞系，可以進行懸浮培養(yǎng)，也可以進行貼壁培養(yǎng)，在應用于蛋白的表達與制備純化中，有著許多的優(yōu)點。目前研究較多的是苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒 (AcMNPV)。桿狀病毒早期啟動子可以在沒有病毒因素的情況下利用細胞轉(zhuǎn)錄機制驅(qū)動基因表達。我們的主要工作是構(gòu)建承載該系統(tǒng)的質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細胞，獲得報告基因的表達情況。此次在昆蟲細胞中對該系統(tǒng)的實踐則是首次。 3) Expressing the foreign protein efficiently, 50% of total 基 于 sf9細胞的藍光誘導表達系統(tǒng)的構(gòu)建 IV amount of protein level in a cell。這些 基因 的啟動子通常包含比較保守的 順式作用元件 ，利用這些保守元件可以推 測新基因的可能功能，也可用這些環(huán)境應答基因的啟動子與抗逆 基因融合 ，從而使轉(zhuǎn)基因生物更好地適應逆境。目前研究最多、最深 入的可誘導表達系統(tǒng)是化學誘導表達系統(tǒng)。根據(jù)控制基因表達的方式，可將化學誘導系統(tǒng)分 為兩大類：阻遏型啟動子系統(tǒng)和激活型啟動子系統(tǒng)。 Love 等用包含四環(huán)素抑制子的啟動子 Topl0 與報告基因 GFP 相連轉(zhuǎn)化擬南芥，發(fā)現(xiàn) 用 100 ng/mL 的四環(huán)素即可抑制 GFP 的表達，而且改變培養(yǎng)基中四環(huán)素的濃度，可調(diào)節(jié) GFP的表達水平。 光控表達系統(tǒng)可以在空間和時間上精確控制轉(zhuǎn)錄，這和很多傳統(tǒng)的誘導表達啟動子不一樣 3。再者光在某種程度上是完全無毒的 對細胞中其它的生化反應無任何影響的條件，這是非光誘導因子所不能做到的，光的激活和去激活作用完成一個循環(huán)后在細胞中可以做到零殘留，這使得實驗條件控制更加理想化，少了一個不可控的變量 5， 6。如能在此方面有重大突破，將帶來光遺傳學的一場革命。這個系統(tǒng)對控制表達的目標蛋白有足夠大的的可調(diào)表達范圍，敏捷的激活和去激活作用，以及對光強足夠高的線性相關性。黑暗時 LOV 結(jié)構(gòu)域結(jié)合者HTH 結(jié)構(gòu)域，覆蓋了對于成為二聚體而結(jié)合到 DNA 所必需的 HTH4α位點。 對 EL222 機制的理解使我們能夠在單一蛋白質(zhì)復合系統(tǒng)中使用光依賴基因激活作用。與之對照，在最小泄露的非誘導條件下，黑暗條件和紅光照射富集倍數(shù)只能有小于 2 的改變?？傊?，已掌握的資料和數(shù)據(jù)突出了 EL222 系統(tǒng)寬廣的通用性以及它作為光遺傳學工具的優(yōu)勢。該實驗中使用的報告基因是螢火蟲熒光素酶基因，通過該酶的活性測定獲得該基因的表達活性 14。 華中農(nóng)業(yè)大學 20xx屆本科畢業(yè)論文 5 pMIB/V5His載體 pMIB/V5His 載體分 A、 B、 C 三型，這次實驗中使用的是 A 型，從Invitrogen公司購買。該載體通常只用于在昆蟲細胞中表達外源蛋白，在其上的多克隆位點中可以很容易插入一段外源序列，而此次我們需要其表達三個外源蛋白： mCherry 紅色熒光蛋白、 EL222轉(zhuǎn)錄因子、 GFP 綠色熒光蛋白，所以，我們采取讓后兩者串聯(lián)表達的方案（使用 2A自剪切多肽）。但用作某些特定需求的基礎研究則會顯得力不從心，如當需要對目標蛋白進行實時控制時。本實驗中在 sf9 細胞中建立的光控表達系 統(tǒng)，已有報道在 293T 細胞中實驗成功，也可以說，這個系統(tǒng)是最初從 293T 細胞中建立起來的 14，我們所做的工作是把該系統(tǒng)移植到基 于 sf9細胞的藍光誘導表達系統(tǒng)的構(gòu)建 6 sf9 細胞中來。 實驗材料 材料與試劑 pMIB/v5his載體 Invitrogen公司 Gel Extraction kit膠回收試劑盒 OMEGA biotek公司 Plasmid mini kit質(zhì)?；厥赵噭┖? OMEGA biotek公司 DH5α感受態(tài) ATCC 限制性內(nèi)切酶 NEB公司 Sf9昆蟲細胞 Invitrogen公司 胎牛血清 FBS GIBCO 公司 Cellfectin174。 華中農(nóng)業(yè)大學 20xx屆本科畢業(yè)論文 7 III、溴化乙錠 (EB)溶液母液 配制終濃度為 10 mg/mL 的 EB 溶液，并室溫保存在棕色瓶子。 VII、 sf9細胞培養(yǎng)液（ 50ml體系） Grace’ s Medium 44ml 胎牛血清 FBS 5ml 雙抗 1ml Total 50ml 注：雙抗指兩種抗生素：青霉素和鏈霉素。 通用 PCR體系及程序 鑒定性質(zhì)的菌液 PCR及質(zhì)粒 PCR在本實驗中皆使用同一種 PCR體系： 模板 1μl 引物 F 1μl 引物 R 1μl dNTPs 10xBuffer 2μl EasyTaq ddH2O Total 20μl PCR 程序： 1） 95℃ 5min； 2) 95℃ 30s； 3) 60℃ 30s； 4) 72℃ ； 5）72℃ 10min。 對于需要回收后產(chǎn)物的 PCR反應，我們使 用 Primer Star代替 EasyTaq，對應的 Buffer也跟著換，程序中變性溫度提高到 98℃。盡可能快，避免紫外線對 DNA 的損傷（控制在 10s 以內(nèi)）；盡可能不切多余的膠塊。去除濾液，加入 500ml Binding Buffer 再次 10000g 1min離心，去濾液； 華中農(nóng)業(yè)大學 20xx屆本科畢業(yè)論文 9 4） 洗柱子。根據(jù)預估 DNA量加入適量 60℃溫水（一般 30μl）， 12min后 120xxg 2min離心洗脫 DNA； 7） 濃度測定。有時候在連接之前（主要是指單酶切的連接反應），需要對載體進行去磷酸化，去磷酸化反應如下： 載體 150ng CIP（ 10/μl） Cutsmart（ 10x) 1μl ddH2O Total 10μl 去磷酸化反應在 37℃處理 30min即可。 質(zhì)粒抽提試劑盒的使用 本次實驗中使用 的質(zhì)粒抽提試劑盒都是同一規(guī)格。 1） 圖 3 中，各步詳細步驟如下：①設計 mCherry 的引物 ，使兩端分別帶有 AgeI 和 SpeI 酶切位點， PCR回收后，同時對載體 pMIB和 mCherry進行雙酶切（ SpeI/AgeI） 2小時，并通過柱回收方式純化酶切產(chǎn)物，然后用 T4 連接酶連接過夜。④其中 GFP 基因為實驗室自有，通過 NheI 酶切位點（事先設計含有 NheI 位點的 GFP 引物）放進 T 載中；而 VPEL222 則通過BsiwI 位點放進同一個 T 載中；這 兩步克隆中，均需使用 CIP 堿性磷酸酶，均包含插入序列的正反鑒定。⑦直接使用 BsiwI酶對載體進行單切并電泳回收，純化后直接自連。 本次實驗需要轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒有兩個： pMIBC120mCherryGFPEL222（以下簡稱為①號）、 pMIBC120mCherryGFP（以下簡稱為②號）。 2） 放置待轉(zhuǎn)染的 sf9 細胞與超凈臺上 15min，吸除平板中的培養(yǎng)基，加入。 4） 將稀釋后的 DNA和轉(zhuǎn)染試劑混合均勻，室溫孵育 1530min。 本次一共設計了四組轉(zhuǎn)染實驗，轉(zhuǎn)染①號質(zhì)粒的光照與黑暗兩組，轉(zhuǎn)染②號質(zhì)粒的光照與黑暗兩組。①號和②號分別為 pMIBC120mCherryGFPEL222 載體的 AgeI/SpeI 和 BsiwI 的酶切條帶；③號和④號分別為 pMIBC120mCherryGFP 載體的 AgeI/SpeI 和 BsiwI 的酶切條帶。 分別轉(zhuǎn)染 pMIBC120mCherryGFPEL222 質(zhì)粒（ 圖 5 中簡稱為①號質(zhì)粒）和 pMIBC120mCherryGFP 質(zhì)粒（圖 5 中簡稱為②號質(zhì)粒）于 sf9 細胞中， 28℃孵育 24h，再施與光照與黑暗兩種條件， 24h 和 48h 后在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光分布情況（圖 5）。 華中農(nóng)業(yè)大學 20xx屆本科畢業(yè)論文 13 從圖 5(a)的數(shù)據(jù)可以看出，該系統(tǒng)在 sf9 細胞中能初步工作，不過其工作效率較低。 圖 5(b)中， 沒有 EL222 的陰性對照和黑暗條件下的對照基本符合預期 ，泄露表達情況很微弱 。后續(xù)實驗中，我們將繼續(xù)摸索轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)條件，多做幾個重復，如果得到的結(jié)果沒有預期改善，則考慮換一種方式表達 EL222 蛋白。 雖然該系統(tǒng)在 sf9細胞中的初次實驗表現(xiàn)不 是很理想，但此次實驗的一個重大成果是證明了 VPEL222光控表達系統(tǒng)能夠在 sf9昆蟲細胞中工作（即是工作效率不高，仍具有借鑒意義）。 Spudich, . Handbook of Photosensory Receptors (WileyVCH, 20xx). 4 Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S. amp。 Quail, . A lightswitchable gene promoter system. Nat. Biotechnol. 20, 1041– 1044 (20xx). 8 Levskaya, A. et al. Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light. Nature 438, 441– 442 (20xx) 9 Yazawa, M., Sadaghiani, ., Hsueh, B. amp。感謝徐富強老師和何曉斌老師給我進入生物磁共振實驗室學習的機會。 焉得諼草，