親和色譜ppt課件(存儲版)
【正文】 分子物質(zhì) 如：純化糖蛋白用凝集素（能可逆性地結(jié)合碳水化合物的蛋白質(zhì)）， LectinSepharose 4B 2) 研究酶的結(jié)構(gòu)與功能： 分離有生物活性與失去生物活性的蛋白質(zhì)。 色譜介質(zhì)制備： ? 將抗體通過化學(xué)方法結(jié)合在色譜介質(zhì)上 ? 抗體之間交聯(lián)形成不溶性衍生物 ? 單抗問世后 , 不少生物技術(shù)公司在研制適宜于培養(yǎng)雜交瘤細胞的生物反應(yīng)器及其培養(yǎng)基。 染料親和色譜介質(zhì)的制備 ? 配基性質(zhì)、染料結(jié)構(gòu)和染料取代度是制備過程中需要考慮的主要因素。 48 ? 將活化的介質(zhì)與金屬螯合劑偶聯(lián) ， 再用金屬離子溶液處理制成金屬螯合親和層析柱 。 親和配基耦聯(lián)密度測定 耦聯(lián)密度決定了介質(zhì)的 吸附容量 ? 分光光度法 ? 量差法分析 ? 水解作用分析 ? 元素分析法 間臂分子 ? 當配基的分子量較小時，將其直接固定在載體上，會由于載體的 空間位阻 ，配基與生物大分子不能發(fā)生有效的親和吸附作用。另外溴化氰活化的基質(zhì)與配體結(jié)合不夠穩(wěn)定，尤其是當與小配體結(jié)合時，可能會出現(xiàn) 配體脫落 現(xiàn)象。雖然這種親和作用的機理尚不十分清楚，但利用固定化組氨酸吸附蛋白質(zhì)以及吸附蛋白的洗脫實驗結(jié)果表明，靜電和疏水性相互作用均有可能參與親和結(jié)合。 （ 5）輔酶和磷酸酰苷 各種脫氫酶和激酶需要在輔酶（ coenzyme）的存在下表現(xiàn)其生物催化活性，即脫氫酶和激酶與輔酶之間具有親和作用。酶的抑制劑在分子大小和形態(tài)上分布較廣，有天然的生物大分子，也有小分子化合物。 ? 理想的配基濃度為 110μmol/L。如生物素和親和素、抗原和抗體、酶和它的抑制劑、激素－受體等，它們結(jié)合都具有很高的特異性，用這些物質(zhì)作為配體都屬于特異性配體。 基質(zhì)的選擇 理想的基質(zhì)應(yīng)符合下面的要求： 1．極低的非特異性吸附。 常見親合作用體系 特異性 親和體系 高特異性 抗原 單克隆抗體 荷爾蒙－受體蛋白 核酸－互補堿基鏈段、核酸結(jié)合蛋白 酶－底物、產(chǎn)物、抑制劑 群特異性 免疫球蛋白－ A蛋白、 G蛋白 酶－輔酶 凝集素－糖、糖蛋白、細胞、細胞表面受體 酶、蛋白質(zhì) 肝素 酶、蛋白質(zhì) 活性色素（染料） 酶、蛋白質(zhì) 過渡金屬離子（銅、鋅等） 酶、蛋白質(zhì)－氨基酸（組氨酸等） 離子強度：一般來說，提高離子強度，親和作用減弱或完成破壞。 ? 生物分子間的 親和識別 包括抗體 抗原、酶 底物、激素 受體等親和作用。 ? 是親和分離技術(shù)中最具優(yōu)勢的方法 含配體溶液 收集目的蛋白 洗下未結(jié)合的蛋白 混合蛋白樣品 平衡液 帶有配體的樹脂珠（或膠粒） 親和層析的基本特點 純化過程簡單、迅速，且分離效率高 特別適用于分離純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子 純化倍數(shù)大，產(chǎn)物純度高 必須針對某一分離對象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件 價格相對較昂貴； 在洗脫中，交聯(lián)在層析介質(zhì)上的配基可能脫落并進入產(chǎn)品中，從而造成不良影響，如抗體、染料等配基。 特異性配體一般是指只與單一或很少種類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體。 ? 配基濃度太高使吸附力太強 ， 洗脫困難 。 在生物體內(nèi)蛋白酶的抑制劑可與蛋白酶的活性部位結(jié)合，抑制酶的活性，必要時保護生物組織不受蛋白酶的損害。例如，常用做親和配基的 伴刀豆球蛋白 A(concanavalin A， con A)與葡聚糖和甘露糖的親和結(jié)合作用較強，而麥芽糖凝集素（ wheat germ agglutinin， WGA）與 N乙酰葡糖胺（ Nacetylglucosamine）的親和結(jié)合作用較強。因此組氨酸可與蛋白質(zhì)發(fā)生親和結(jié)合作用。反應(yīng)如下： 介質(zhì)活化與耦聯(lián) 活化耦聯(lián)
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1