親和色譜ppt課件(參考版)
2025-05-08 22:19本頁面
【正文】 ? 蛋白 A親和色譜 ? 伴刀豆球蛋白 A親和色譜 ? 肝素親和色譜 1）分離純化大分子物質(zhì) 如：純化糖蛋白用凝集素（能可逆性地結(jié)合碳水化合物的蛋白質(zhì)）， LectinSepharose 4B 2) 研究酶的結(jié)構(gòu)與功能： 分離有生物活性與失去生物活性的蛋白質(zhì)。結(jié)果表明 , Sz95 Sepharose 4B 親和色譜柱的偶聯(lián)率為 72%, 每1mL血小板破碎液中可以純化到 PF4 18 μg。 應(yīng)用 ? 根據(jù)研究報(bào)道 , 用單克隆抗體親和色譜從人血小板破碎液中純化 血小板第 4 因子 (PF4)。 ? 隨著新的合成基質(zhì)和偶聯(lián)化合物的出現(xiàn)以及對(duì)免疫親和色譜研究的深入 , 必將使免疫親和色譜在工業(yè)性生產(chǎn)純化蛋白質(zhì)的應(yīng)用上逐漸得到發(fā)展。 色譜介質(zhì)制備： ? 將抗體通過化學(xué)方法結(jié)合在色譜介質(zhì)上 ? 抗體之間交聯(lián)形成不溶性衍生物 ? 單抗問世后 , 不少生物技術(shù)公司在研制適宜于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的生物反應(yīng)器及其培養(yǎng)基。 ? 特點(diǎn)：分離效率高，成本高，而且蛋白質(zhì)親和配基不穩(wěn)定，容易降解。 免疫親和色譜 ? 抗原和抗體的作用具有高度的專一性 , 并且它們的結(jié)合親和力極強(qiáng)。 ? 染料也可通過活性基團(tuán)和基質(zhì)偶聯(lián)，該方法可引入高密度的染料。 染料親和色譜介質(zhì)的制備 ? 配基性質(zhì)、染料結(jié)構(gòu)和染料取代度是制備過程中需要考慮的主要因素。 ? 染料共價(jià)偶聯(lián)到瓊脂糖載體上 ， 能制得親和層析柱 。 pH與氯化銨濃度的影響 固定化親和離子色譜的應(yīng)用 ? 基因修飾蛋白質(zhì)的純化 ? 遺傳修飾 → 具親和尾蛋白 → 色譜分離 → 親和尾切除 → 色譜分離 酶切位點(diǎn) 親和尾大小 54 染料親和色譜 ? 有機(jī)染料具有類似于 NAD+的結(jié)構(gòu) 。 ? 平衡緩沖溶液洗去未螯合的金屬離子 ? 加入適宜濃度的 NaCl和選擇合適 pH值有利于減少非特異性吸附。 48 ? 將活化的介質(zhì)與金屬螯合劑偶聯(lián) ， 再用金屬離子溶液處理制成金屬螯合親和層析柱 。 常見的親和色譜 ? 核苷酸及輔酶親和色譜 ? 固定化金屬離子親和色譜 ? 染料親和色譜 ? 免疫親和色譜 ? 基團(tuán)專一性大分子親和色譜 核苷酸及輔酶親和色譜 ? 指將核苷酸（或輔酶）作為親和配基固定在色譜介質(zhì)上進(jìn)行親和色譜的技術(shù)，主要利用核苷酸特別是輔酶因子和蛋白質(zhì)之間的專一性識(shí)別達(dá)到分離純化目的 介質(zhì)制備 ? 碳二亞胺直接法偶聯(lián) 溴化氫活化瓊脂糖 → 連接氨基己酸 → 加入核苷酸 → 溶液 中保存 → 洗滌 → 偶聯(lián) ? 間接偶聯(lián)法 間臂分子和核苷酸 → 活化的介質(zhì) 吸附和解吸 ? 選擇合適的緩沖液條件下吸附 ? 一般采用輔酶或鹽溶液進(jìn)行梯度洗脫 固定化金屬離子親和色譜 ? 蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基 ， 如 組氨酸的咪唑基 、 半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基 ， 有利于蛋白質(zhì)與固定化金屬離子結(jié)合 ， 從而達(dá)到分離的目的 。 ? 間臂的疏水性也需要考慮，應(yīng)盡量減小對(duì)配基的影響。 A C v er 99032 6 30St eric con sid erat ion s amp。 親和配基耦聯(lián)密度測(cè)定 耦聯(lián)密度決定了介質(zhì)的 吸附容量 ? 分光光度法 ? 量差法分析 ? 水解作用分析 ? 元素分析法 間臂分子 ? 當(dāng)配基的分子量較小時(shí)，將其直接固定在載體上，會(huì)由于載體的 空間位阻 ，配基與生物大分子不能發(fā)生有效的親和吸附作用。 上面兩種方法是比較常用的方法 。它的缺點(diǎn)是用 環(huán)氧氯丙烷 活化的基質(zhì)在與配體偶聯(lián)時(shí)需要堿性條件， pH 為 913，溫度為 2040℃ 。 環(huán)氧基活化法 在熱的濃堿溶液中 ， 多糖類化合物與環(huán)氧氯丙烷作用生成環(huán)氧化合物；
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