【正文】 的菌落為灰白色或微帶紅色，具紫紅色背景(表示不發(fā)酵甘露醇)環(huán)繞有白色至淡粉紅色的暈(表示產(chǎn)生卵磷脂酶)。（4）與類似菌鑒別。7 思考題如何區(qū)分蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌？實(shí)驗(yàn)8 食品中副溶血性弧菌的檢驗(yàn)1 目的要求（1）了解副溶血性弧菌的生長特性。4 實(shí)驗(yàn)方法與步驟4．1 副溶血性弧菌的檢測程序（表351）37℃，18～24h37℃，18～24h37℃8～16h樣品25g加225mL ％滅菌鹽水，磨碎氯化鈉結(jié)晶紫增菌液100mL氯化鈉蔗糖瓊脂平板和選擇性瓊脂平板％氯化鈉三糖鐵斜面嗜鹽性試驗(yàn)涂片革蘭氏染色鏡檢形態(tài)生化試驗(yàn)報告圖351 食品中副溶血性弧菌的檢驗(yàn)程序4．2樣品處理準(zhǔn)備好滅菌用具及容器，以無菌操作取有代表性的樣品25g，%滅菌鹽水中，用均質(zhì)器打碎或用力搖勻10～20min。6 注意事項(xiàng)（1）副溶血性弧菌在適宜溫度下繁殖較快，但不適于在低溫生存，在寒冷的情況下容易死亡，所以應(yīng)防止待檢材料冷凍，以免影響檢驗(yàn)結(jié)果?？漳c彎曲桿菌是一類微需氧菌，初次分離時需在含5%O285%N210%CO2環(huán)境中，該菌相對脆弱，對周圍環(huán)境敏感，如對干燥、加熱、消毒、酸性和21%氧氣都敏感。3．4其他用品 生化試劑。4．2 分離和初步鑒定取5mL經(jīng)20～44h增菌的培養(yǎng)物。4．3 證實(shí)試驗(yàn)從用作純分離的平板上挑選二個典型菌落。對未生長者，需培養(yǎng)5d方可作出最后判斷。(6) %氯化鈉中生長試驗(yàn)%氯化鈉的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置空氣中于37℃，對未生長者需培養(yǎng)5d，方可作出最后判斷。(:1丙酮和丁醇中)，室溫下放置2h，出現(xiàn)紫色者為陽性反應(yīng)。6 注意事項(xiàng)（1）所檢樣品在室溫中放置不能超過24h，樣品在分離前需放冰箱或冷處保存。肉毒梭狀芽孢桿菌具有4～8根周毛性鞭毛，運(yùn)動遲緩；沒有莢膜。引起人群中毒的，主要有A、B、E三型。3 實(shí)驗(yàn)材料3．1 樣品 罐頭、臭豆腐、豆瓣醬、面醬、豆豉等發(fā)酵食品。檢出試驗(yàn)：取上述離心上清液及其胰酶激活處理液分別注射小白鼠2只，觀察4d。根據(jù)動物死亡情況，計算檢樣中所含肉毒毒素的大體毒力(MLD／mL或MLD／g)。4．3 肉毒梭菌的檢驗(yàn)與分離鑒定肉毒梭菌檢驗(yàn)方法的重點(diǎn)乃是產(chǎn)毒及毒素的檢出試驗(yàn)，如要證實(shí)是否有肉毒梭菌存在，只要分離、培養(yǎng)、毒素鑒定即可。肉毒梭菌只有在厭氧條件下才能在卵黃瓊脂平板上生長并形成具有上述特征的菌落，而在需氧條件下則不生長。（2）熟悉單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的分離鑒定方法。該菌的生長范圍為2～42℃（也有報道在0℃能緩慢生長），最適培養(yǎng)溫度為35～37℃，在pH中性至弱堿性（）、氧分壓略低、二氧化碳張力略高的條件下該菌生長良好，～，% NaCl 肉湯中生長良好。3．4其他 均質(zhì)器、顯微鏡、小鼠。30℃TSAYE平板培養(yǎng)24～48h，如果不用于動力觀察，也可在35℃培養(yǎng)。食品檢驗(yàn)中在TSAYE平板上純化是必須的，因?yàn)樵贛MA平板上分離菌落時可能沾有不可見的受抑微生物。3．2 食品 雞肉、生牛排、鮮牛奶、芹菜。該菌為革蘭氏陽性短桿菌，大小約為（～）μm（～）μm，直或稍彎，兩端鈍圓，常呈V字型排列，偶有球狀、雙球狀，兼性厭氧、無芽孢，一般不形成莢膜，但在營養(yǎng)豐富的環(huán)境中可形成莢膜，在陳舊培養(yǎng)中的菌體可呈絲狀及革蘭氏陰性，該菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脫落。小白鼠的飼料與水必須及時添加、充分供應(yīng)。根據(jù)菌落形態(tài)及菌體形態(tài)挑取可疑菌落，接種皰肉培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)5d，進(jìn)行毒素檢測及培養(yǎng)特性檢查確證試驗(yàn)。檢出肉毒梭菌，但未檢出肉毒毒素，不能證明此食物會引起肉毒中毒。3份混合液分別注射小白鼠各2只，觀察4d，若注射加診斷血清與煮沸加熱的2份混合液的小白鼠均獲保護(hù)存活，而唯有注射未經(jīng)其他處理的混合液的小白鼠以特有癥狀死亡，則可判定檢樣中有肉毒毒素存在，必要時進(jìn)行毒力測定及定型試驗(yàn)。另取一部分上清液，調(diào)pH6．2，每9份加10％胰酶(活力1：250)水溶液一份，混勻，經(jīng)常輕輕攪動，37℃作用60min，進(jìn)行檢測。肉毒中毒是由于誤食含有肉毒毒素的食品而引起的純粹的細(xì)菌毒素食物中毒。肉毒梭菌的致病性在于所產(chǎn)生的神經(jīng)毒素即肉毒毒素，而細(xì)菌本身則是一種腐生菌。其它引起中毒的食品還有：熏制未去內(nèi)臟的魚、填餡茄子、油浸大蒜、烤土豆、炒洋蔥、蜂蜜制品等。R為耐受，S為敏感。(10) 馬尿酸鹽水解試驗(yàn)用試管分裝馬尿酸鹽水解培養(yǎng)基，凍存?zhèn)溆?。加入亞硝酸鹽檢測試劑，出現(xiàn)紅色者為陽性反應(yīng)。另二管分別置于25℃和42℃培養(yǎng)。挑取初步鑒定為彎曲桿菌的菌落，在布氏瓊脂上劃線作純分離。于微需氧條件下，35℃預(yù)增菌4h后，42℃培養(yǎng)20～44h。3．2檢樣 碎牛肉、牛奶、雞、污水?？漳c彎曲桿菌已涉及生的和未煮熟的雞、生的和巴氏殺菌不徹底的牛奶、蛋制品、生火腿、未經(jīng)氯處理的水。4．8生化試驗(yàn)分別接種下列各類微量生化培養(yǎng)基：葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基紅、靛基質(zhì)、VP，賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸、硫化氫及溶血性試驗(yàn)，放37℃培養(yǎng)，除VP、靛基質(zhì)和甲基紅試驗(yàn)培養(yǎng)48h后加試劑觀察外，其他均在24h觀察結(jié)果。3．2 檢樣 魚類、貝類。如有游離芽孢和深染了的，似菱形的紅色結(jié)晶小體即為蘇云金芽孢桿菌（如游離芽孢未形成，培養(yǎng)物應(yīng)放置室溫再保持1～2d后查檢），而蠟樣芽孢桿菌用此法檢查為陰性。瓊脂平板上形成的菌落不透明，表面粗糙，似毛玻璃狀或融蠟狀且邊緣不齊。1℃ 20h12～檢樣做成101~105的稀釋液選擇性培養(yǎng)基（菌數(shù)測定）菌數(shù)測定選擇性培養(yǎng)基（分離培養(yǎng)）肉湯培養(yǎng)基，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基生長及菌落觀察染色鏡檢生化試驗(yàn)生化試驗(yàn)報告37℃，18～24h圖34－1 蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)程序4．2 菌數(shù)測定以無菌操作將檢樣25g或25mL按菌落總數(shù)測定方式，用滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液做成101～105的稀釋液。2 基本原理蠟樣芽孢桿菌為需氧、能產(chǎn)生芽孢的革蘭氏陽性桿菌，在自然界分布較廣，食品在正常情況下就可能有此菌存在，因而易從各種食品中檢出。若呈現(xiàn)凝集，則用AA2群多價和D群血清分別試驗(yàn)。志賀氏菌在這些培養(yǎng)基上呈現(xiàn)無色透明的中等大小的光滑型菌落。3．2 設(shè)備和材料天平、均質(zhì)器或研缽、培養(yǎng)箱、顯微鏡、滅菌廣口瓶、滅菌平皿、酒精燈、載玻片、滅菌金屬匙或玻璃棒、接種棒、試管架。已知具有Vi抗原的菌型有傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌。 不被A—F多價O血清凝集者，先用57種或144種沙門氏菌因子血清中的7種多價O血清檢查，如有其中一種血清凝集，則用這種血清所包括的O群血清逐一檢查，以確定O群。如果未做KCN試驗(yàn)時，常需做VP試驗(yàn)（22～250C，4天），哈夫尼亞菌屬為陽性。（3）＋陽性、－陰性、＋/－多數(shù)陽性、少數(shù)陰性。表322 腸桿菌科各菌屬在三糖鐵瓊脂內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果斜面底層產(chǎn)氣H2S可能的菌屬－＋＋/－＋沙門氏菌屬、變形桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬、愛德華氏菌屬＋＋＋/－＋沙門氏菌屬亞屬Ⅲ、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬－＋＋－沙門氏菌屬、埃希氏菌屬、哈夫尼亞菌屬、摩根氏菌屬、普羅菲登斯菌屬－＋－－傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌、志賀氏菌屬、埃希氏菌屬、哈夫尼亞菌屬、摩根氏菌屬、普羅菲登斯菌屬＋＋＋/－－埃希氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、枸櫞酸桿菌屬該表說明在三糖鐵瓊脂內(nèi)只有斜面產(chǎn)酸并同時H2S陰性的菌株可以排除，其它的反應(yīng)結(jié)果均有沙門氏菌的可能，同時也均有不是沙門氏菌的可能。DHL瓊脂無色半透明，產(chǎn)生H2S菌落中心帶黑色或幾乎全黑色。一般4h，干蛋品18～24h36177。l℃培養(yǎng)18～24h。3 實(shí)驗(yàn)材料3．1設(shè)備和材料 天平、均質(zhì)器或研缽、培養(yǎng)箱、顯微鏡、滅菌廣口瓶、滅菌三角燒瓶、滅菌吸管（l0mL）、滅菌平皿、滅菌小玻管、滅菌毛細(xì)吸管、橡皮乳頭、載玻片、酒精燈、滅菌金屬匙或玻璃棒、接種棒、試管架等。2 基本原理沙門氏菌屬是腸道桿菌科中最重要的病原菌屬，它是引起人類和動物發(fā)病及食物中毒的主要病原菌之一。乙型溶血性鏈球菌菌落周圍呈完全溶血，并有明顯的溶血境界。若24h后不溶解即為陰性。4．5 培養(yǎng)特性該菌營養(yǎng)要求較高，在普通培養(yǎng)基上生長不良，在加有血液、血清培養(yǎng)基中生長較好。4 實(shí)驗(yàn)方法與步驟：4．1溶血性鏈球菌檢驗(yàn)程序（如圖311）36177。（2）實(shí)驗(yàn)中操作者須注意生物安全防護(hù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后要消毒環(huán)境，把實(shí)驗(yàn)材料高壓滅菌后方可清洗或棄之。1℃24h培養(yǎng)后進(jìn)行染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)，步驟同增菌培養(yǎng)法。（5）血漿凝固酶試驗(yàn)吸取1∶，放入小試管中，振蕩搖勻，放36177。（2）增菌及分離培養(yǎng)吸取5mL上述混懸液，%氯化鈉肉湯或胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置36177。2 基本原理金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生多種毒素和酶。所以大腸菌群的測定是必做的食品衛(wèi)生學(xué)檢項(xiàng)目。新近隨糞便排出的大腸菌多屬于這一類型。30mL和10mL乳糖發(fā)酵管專供醬油及醬類檢驗(yàn)用，3mL乳糖發(fā)酵管供大腸菌群證實(shí)試驗(yàn)用。4．3 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)將待稀釋檢樣品接種乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管，每一稀釋度接種3管，置36+1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24+2h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，可報告為大腸菌群陰性。2 基本原理大腸菌群系指一群在37℃24hr能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或兼性厭氧的埃希氏無芽孢桿菌。6 注意事項(xiàng)（1）若實(shí)驗(yàn)樣品為食品，為防止食品碎屑混入瓊脂影響計數(shù)，通常需在瓊脂中添加一定量TTC(氯化三苯四氮唑)，%TTC，培養(yǎng)后，如系食品顆粒，不見變化，如為細(xì)菌，則生成紅色菌落。(2) 稀釋度的選擇A．應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30～300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報告之。4 實(shí)驗(yàn)方法與步驟 4．1 菌落總數(shù)實(shí)驗(yàn)程序（如圖281）4．2 檢樣稀釋及培養(yǎng)（1）以無菌操作將檢樣25g(25mL)剪碎放于裝有225mL滅菌生理鹽水和玻璃珠的三角瓶內(nèi)，經(jīng)過充分振蕩或均質(zhì)處理制作成1：10的均勻稀釋液（固體食品有的需先用滅菌研缽研磨后再稀釋）。反之，菌落總數(shù)就越高。（2）了解食品清潔程度（被污染程度）及觀察細(xì)菌在食品中繁殖的動態(tài)，從而為被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評價時提供依據(jù)。因此，這種方法所得到的結(jié)果，實(shí)際上只包括一群在普通營養(yǎng)瓊脂中發(fā)育、嗜中溫的需氧和兼性厭氧的細(xì)菌菌落的總數(shù)。（4）稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時將融化并冷卻到46℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15mL，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻，同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入加有無菌生理鹽水的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。D．若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最底的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。（3）目前還有幾種快速檢測菌落總數(shù)的方法如由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院研制而成食品細(xì)菌檢驗(yàn)箱，菌落總數(shù)測定采用試管斜面計數(shù)法操作簡便，不易受污染，結(jié)果與國標(biāo)法平板計數(shù)一致。根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽性管數(shù)，查MPN檢索表，報告每100mL（g）大腸菌群的最可能數(shù)（食品中大腸菌群系以每100mL（g）檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)MPN表示），MPN最可能數(shù)是表示樣品中活菌密度的估計。典型的大腸埃希氏菌落呈紫黑色金屬光澤，非典型大腸菌群有時為紅色菌落。如果平板出現(xiàn)典型的大腸菌菌落，G染色陰性無芽孢菌，即可做出判定。這種變化以生化變異為主。3M中國有限公司提供的petrifilm plates測試片，可在２４小時確定大腸菌群數(shù)。在肉湯中生長時，菌體可生成血漿凝固酶并釋放于培養(yǎng)基中（叫做游離凝固酶）。（3）形態(tài)金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列是葡萄球狀，無芽孢，無莢膜，致病性葡萄球菌菌體較小，～1μm。4．3 直接計數(shù)法（1）吸取上述1：10混懸液，進(jìn)行10倍系列稀釋，根據(jù)樣品污染情況，選擇不同濃度的稀釋液1mL，分別加入到三塊Baird－Parker平板中，、然后用滅菌L棒涂布整個平板。細(xì)菌繁殖時呈多個平面的不規(guī)則分裂，堆積成葡萄串狀。（3）觀察乙型溶血性鏈球菌產(chǎn)生鏈激酶的現(xiàn)象以及桿菌肽敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果。１℃24h24h鏈激酶試驗(yàn)桿菌肽敏感試驗(yàn)觀察溶血革蘭氏染色報 告圖311 溶血性鏈球菌檢驗(yàn)程序4．2 樣品處理稱取25g固體檢樣或稱取25mL液體檢樣，加入225mL滅菌生理鹽水制成混懸液。4．6 鏈激酶試驗(yàn)致病性乙型溶血性鏈球菌能產(chǎn)生鏈激酶(即溶纖維蛋白酶)，此酶能激活正常人體血液中的血漿蛋白酶原成為血漿蛋白酶，而后溶解纖維蛋白。1℃下培養(yǎng)18～24h，如有抑菌帶出現(xiàn)即為陽性。6 注意事項(xiàng)（1）做鏈激酶實(shí)驗(yàn)時注意人血漿應(yīng)新鮮。沙門氏菌屬是一群血清學(xué)上相關(guān)的需氧，無芽孢的革蘭氏陰性桿菌，周身鞭毛，能運(yùn)動，不發(fā)酵側(cè)金盞花醇、乳糖及蔗糖，不液化明膠，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，不分解尿素，能有規(guī)律地發(fā)酵葡萄糖并產(chǎn)生氣體。4 實(shí)驗(yàn)方法與步驟4．1 沙門氏菌屬檢驗(yàn)程序（如圖321）4．2 前增菌和增菌凍肉、蛋品、乳品及其它加工食品均應(yīng)經(jīng)過前增菌。l℃，培養(yǎng)18～24h。1℃18～24h36177。乳糖陽性的菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色；乳糖遲緩陽性或陰性的菌株為藍(lán)綠色或藍(lán)色，中心黑色或幾乎全黑色。l℃培養(yǎng)1824h，必要時可延長至48小時，按表323判斷結(jié)果。如有兩項(xiàng)異常，則按A3，判定為枸櫞酸桿菌。H抗原發(fā)育不良時，～％半固體瓊脂平板的中央，待菌落蔓延生長后，在其邊緣部分取菌檢查，～％半固體瓊脂的小玻管1～2次，自遠(yuǎn)端取菌培養(yǎng)后再檢查。每一個H抗原成分的最后確定均應(yīng)根據(jù)H單因子血清的檢查結(jié)果，沒有H單因子血清的要用兩個H復(fù)合因子血清進(jìn)行核對。（2）學(xué)習(xí)志賀氏屬菌檢驗(yàn)的基本原理和方法。1℃培養(yǎng)6～8h。然后再做VP\苯丙氨酸脫氨酶、賴氨酸脫羧